Purificazione dei peptidi: una tecnica basata su RP-HPLC per estrarre peptidi da lisati proteici digeriti

Abstract

Fonte: Cheng, L. C. et al. Arricchimento di fosfopeptide accoppiato con spettrometria di massa quantitativa senza etichetta per studiare il fosfoproteoma nel cancro alla prostata. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, dimostriamo la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa per purificare i peptidi da una miscela di lisato proteico digerito. Questi peptidi purificati vengono quindi liofilizzati e conservati per applicazioni a valle. L'analisi dei peptidi può aiutare a comprendere i meccanismi coinvolti nella segnalazione cellulare e nel cancro.

Protocollo

1. Estrazione a Fase Inversa

1. Inizia con un lisato proteico predigerito in una fiala di vetro. Filtrare il campione utilizzando un filtro di cutoff da 15 mL 10 kDa. Centrifugare il campione a 3.500 x g utilizzando il rotore a secchiello oscillante (o 3.500 x g in un rotore ad angolo fisso) a 15 °C fino a quando il volume del retentato è inferiore a 250 μL (questo richiede circa 45 - 60 minuti). Raccogli il flusso e scarta il retentato.
   NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui. Congelare i campioni a -80 °C per un uso successivo.
2. Per acidificare il campione, aggiungere circa 20 μL di acido trifluoroacetico (TFA) al 5% per mL di lisato. Mescolarli bene e misurare il pH del campione utilizzando strisce di pH. Regolare il pH a 2,5 utilizzando il 5% di TFA.
3. Collegare l'estremità più corta di una colonna C-18 a un collettore a vuoto. Impostare il vuoto tra 17 e 34 kPa (o secondo le istruzioni del produttore). Utilizzando pipette di vetro, bagnare la colonna con 3 mL di acetonitrile al 100% (ACN). Non lasciare asciugare la colonna.
4. Utilizzando pipette di vetro, equilibrare la colonna con 6 mL di TFA allo 0,1% applicati come 2x 3mL. Caricare il campione acidificato nella colonna. Non aggiungere più di 3 ml alla volta. Regola il vuoto in modo che miri a circa 1 o 2 gocce al secondo.
5. Utilizzando pipette di vetro, lavare la colonna con 9 mL di TFA allo 0,1% applicati come 3x 3mL. Eluire la colonna con 2 mL di ACN al 40%, TFA allo 0,1%. Raccogliere due frazioni da 2 mL in provette di coltura in vetro. Eliminare la colonna.
6. Coprire i tubi di eluato con parafilm e praticare 3-5 fori sul coperchio utilizzando un ago da 20G. Congelare l'eluato su ghiaccio secco per almeno 30 minuti fino a quando non si solidifica completamente.
7. Liofilizzare le frazioni durante la notte. Il giorno seguente, assicurarsi che i campioni siano completamente asciutti prima di interrompere il liofilizzatore. Conservare le provette in una provetta conica da 50 ml con salviette delicate a -80 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Congelatore a bassissima temperatura	Pananica	in MDF-U76V
Congelatore -20 °C	VWR	SCPMF-2020
Benna a rotore oscillante	ThermoFisher Scientifico	75004377
Collettore vuoto	Restek	Codice 26080
Liofilizzante	Labconco	7420020
Concentratore a vuoto da banco CentriVap	Labconco	7810010
Unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-15	Millipore Sigma	UFC901024
Rotatore end-over-end	ThermoFisher Scientifico	415110Q
Provette per coltura in vetro	Fisher Scientifico	14-961-26
Parafilm	Fisher Scientifico	13-374-12
Ago da 20 G	Bd	B305175
Salviette Kimwipes	Fisher Scientifico	06-666A
Criotubo con tappo a vite	ThermoFisher Scientifico	379189
Provette coniche Nunc 15 mL	ThermoFisher Scientifico	12-565-268
Provette Eppendorf a basso legame proteico	Eppendorf	22431081
Siringa da 3 ml	Bd	309657
Acido trifluoracetico (TFA)	Fisher Scientifico	Codice: PI-28904
Acetonitrile (ACN)	Fisher Scientifico	A21-1
MilliQ acqua			Acqua deionizzata utilizzata per preparare tutte le soluzioni e i tamponi