Arricchimento di fosfopeptidi: una tecnica di immunoprecipitazione basata su anticorpi per separare specifici peptidi fosforilati da miscele di peptidi complessi

Abstract

Fonte: Cheng, L. C., et al. Arricchimento di fosfopeptidi accoppiato con spettrometria di massa quantitativa senza etichetta per studiare il fosfoproteoma nel cancro alla prostata. J. Vis. Exp. (2018).

In questo video, dimostriamo l'immunoprecipitazione dei fosfopeptidi basata su anticorpi da una miscela di peptidi. I fosfopeptidi arricchiti sono concentrati sotto vuoto e conservati per l'analisi a valle.

Protocollo

1. Immunoprecipitazione e arricchimento dei peptidi pY

1. Risospendere la polvere liofilizzata di peptidi purificati con 0,5 mL di tampone legante l'immunoprecipitazione (IP) ghiacciata in ciascuna frazione. Raggruppare le frazioni trasferendo il volume di risospensione di 0,5 mL dalla seconda frazione alla prima frazione e conservare il puntale della pipetta. Agitare energicamente (invece di pipettare su e giù) per assicurarsi che il campione sia completamente sciolto prima di trasferirlo in una provetta criogenica con tappo a vite da 3,6 mL.
2. Sciacquare le provette di liofilizzazione con altri 0,5 mL di tampone legante IP (Tabella 1) in ciascuna provetta. Trasferire la soluzione nella provetta da 3,6 mL con tappo a vite utilizzando lo stesso puntale della pipetta per ridurre al minimo la perdita di campione. Ripetere il risciacquo 1 volta in più, portando il volume di risospensione finale a 2 ml (per 5 mg di proteine). Misurare il pH del campione per assicurarsi che sia di circa 7,4. Se è troppo acido, aggiungere iterativamente 10 μL di Tris 1M (non titolato, pH ~11). Se è troppo basico, aggiungere iterativamente 10 μL di HCl diluito (1:25 o 1:100).
3. Prelavare le perle di pY (per 5 mg di lisato di partenza)
   1. Per campione sono necessari 25 μg di anticorpi 4G10 e 12,5 μg di anticorpi 27B10.4. Dopo aver utilizzato una pipetta p200 con una punta tagliata per trasferire gli anticorpi in provette separate per microcentrifuga, lavare gli anticorpi con 450 μl di tampone legante IP ghiacciato 2x. Centrifugarli a 100 x g per 1 minuto a 4 °C e aspirare il surnatante.
   2. Risospendere le perle a una concentrazione madre di 0,5 mg/mL utilizzando il tampone legante IP. (Non agitare le perline.) Dopo aver aliquotato il liquame necessario (50 μl di liquame di anticorpi 4G10 e 25 μl di liquame anticorpale 27B10.4 per campione) in un'unica provetta, centrifugare le provette da centrifuga a 200 x g per 1 minuto a 4 °C. Lavare le pareti laterali con surnatante prima di riporre le perle in frigorifero.
4. Aggiungere perle di pY prelavate alla soluzione del campione risospeso nelle crioprovette con tappo a vite. Incubarli a 4 °C su un rotatore end-over-end per una notte.
5. Posizionare le provette criogeniche con tappo a vite in una provetta da centrifuga da 50 ml rivestita con un panno delicato. Centrifugare le perline a 100 x g per 1 min. Conservare il surnatante, che verrà utilizzato per arricchire i peptidi pST.
6. Risospendere le perle con 300 μL di tampone di legame IP. Trasferirli in una provetta da microcentrifuga da 2 ml e centrifugarli a 100 x g per 1 minuto a 4 °C.
7. Sciacquare la provetta di incubazione 3 volte con 200 μl di tampone legante IP. Trasferire ogni volta il contenuto nella stessa provetta da microcentrifuga. Quindi, girali verso il basso.
8. Lavare le perle nella provetta da microcentrifuga 3 volte con 500 μL di tampone legante IP e centrifugarle a 100 x g per 1 minuto. Quindi, lavare le perle 4 volte con 450 μL di 25 mM NH₄HCO₃, pH 7,5 e centrifugarle a 100 x g per 1 minuto. Utilizzare ogni volta una soluzione fresca da 25 mM di NH₄HCO₃ da polvere.
9. Centrifugare le perle a 1.500 x g per 1 minuto. Utilizzare una punta di caricamento del gel per rimuovere completamente il surnatante immergendo la punta della punta di caricamento del gel leggermente sotto la superficie delle perline.
10. Aggiungere 4 volte il volume del perlato dello 0,1% TFA alle perle (ad esempio, aggiungere 300 μl di TFA allo 0,1% per 75 μg di liquame di perline pY). Mescolarli bene e incubare la miscela in un termomixer a 1.000 giri/min per 15 minuti a 37 °C.
11. Trasferire la risospensione in un filtro di centrifuga da 0,2 μm. Avvitare rapidamente il tubo di eluizione e trasferire il volume residuo nello stesso filtro rotante utilizzando una pipetta P10. Abbassare il filtro centrifugo a 850 x g per 1 min. Trasferire l'eluizione in una provetta da microcentrifuga a basso legame proteico. Concentrare l'eluato sottovuoto fino a essiccarlo per una notte a 40 °C e con un tempo di riscaldamento di 300 min.
    nota: L'esperimento può essere messo in pausa qui. Congelare i campioni a -80 °C e continuare in un secondo momento.

Tabella 1: Buffer e soluzioni.Questa tabella mostra le composizioni dei tamponi e delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.

buffer	volume	composizione
6 M Tampone di lisi del cloruro di guanidinio	50 ml	6 M di guanidinio cloruro, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM di tris (2-carbossietil) fosfina, 40 mM di cloroacetammide, 2 mM di ortovanadato di sodio, 2,5 mM di pirofosfato di sodio, 1 mM di β-glicerofosfato, 500 mg di n-ottil-glicoside, acqua ultrapura a volume
100 mM di pirofosfato di sodio	50 ml	2,23 g di pirofosfato di sodio decaidrato, acqua ultrapura in volume
1M β-glicerofosfato	50 ml	15,31 g β-glicerofosfato, acqua ultrapura a volume
5% di acido trifluoroacetico	20 ml	Aggiungere 1 mL di acido trifluoroacetico al 100% in 19 mL di acqua ultrapura
0,1% di acido trifluoroacetico	250 ml	Aggiungere 5 mL di acido trifluoroacetico al 5% a 245 mL di acqua ultrapura
tampone di eluizione pY	250 ml	0,1% acido trifluoroacetico, 40% acetonitrile, acqua ultrapura a volume
tampone di eluizione pST	250 ml	0,1% acido trifluoroacetico, 50% acetonitrile, acqua ultrapura a volume
Buffer di binding IP	200 ml	50 mM tris pH 7,4, 50 mM di cloruro di sodio, acqua ultrapura a volume
25 mM di bicarbonato di ammonio, pH 7,5	10 ml	Sciogliere 19,7 mg in 10 mL di acqua sterile ultrapura, pH a 7,5 con acido cloridrico 1 N (~10-15 μL/10 ml di soluzione), preparare fresco
1M tampone fosfato, pH 7	1.000 ml	423 mL di sodio diidrogeno fosfato 1 M, 577 mL di sodio 1 M idrogeno fosfato
Tampone di equilibratura	14 ml	6,3 mL di acetonitrile, 280 μL di acido trifluoroacetico al 5%, 1740 μL di acido lattico, 5,68 mL di acqua ultrapura
Tampone di risciacquo	20 ml	9 mL di acetonitrile, 400 μL di acido trifluoroacetico al 5%, 10,6 mL di acqua ultrapura
Soluzione per spettrometria di massa	10 ml	500 μL di acetonitrile, 200 μL di acido trifluoroacetico al 5%, 9,3 mL di acqua ultrapura
Buffer A	250 ml	5 mM di fosfato monopotassico (pH 2,65), 30% di acetonitrile, 5 mM di cloruro di potassio, acqua ultrapura a volume
Buffer B	250 ml	5 mM di fosfato monopotassico (pH 2,65), 30% di acetonitrile, 350 mM di cloruro di potassio, acqua ultrapura a volume
0,9% Idrossido di ammonio	10 ml	300 μl di idrossido di ammonio al 29,42%, 9,7 ml di acqua ultrapura

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Liofilizzante	Labconco	7420020
Concentratore a vuoto da banco CentriVap	Labconco	7810010
Salviette Kimwipes	Fisher Scientifico	06-666A
Filtro rotante Millipore da 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Provette Eppendorf a basso legame proteico	Eppendorf	22431081
anti-Fosfotirosina, Agarosio, Clone: 4G10	Millipore Sigma	Codice: 16101
Anticorpo 27B10.4	Citoscheletro	APY03-perline
Kit di analisi di peptidi	Termo Scientifico	Codice 23275
TopTip	PolyLC Inc	TT200TIO.96
Colonne SCX (PolySULFOETHYL A)	PolyLC Inc	SPESE1203
Siringa da 3 ml	Bd	309657
MilliQ acqua			Acqua deionizzata utilizzata per preparare tutte le soluzioni e i tamponi
Acido trifluoracetico (TFA)	Fisher Scientifico	Codice: PI-28904
Acetonitrile (ACN)	Fisher Scientifico	A21-1
cloruro di potassio	Fisher Scientifico	BP366-500
acido lattico	Sigma-Aldrich	69785-250ML
Idrossido di ammonio	Fisher Scientifico	A669S-500
Tris Base	Fisher Scientifico	BP152-5