Arricchimento di fosfopeptidi a base di biossido di titanio: un metodo per l'isolamento selettivo di fosfopeptidi dalla libreria di peptidi

Abstract

Fonte: Cheng, L. C. et al. Arricchimento di fosfopeptide accoppiato con spettrometria di massa quantitativa senza etichetta per studiare il fosfoproteoma nel cancro alla prostata. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra l'arricchimento a base di biossido di titanio di fosfopeptidi estratti dal tessuto tumorale della prostata. Questi fosfopeptidi arricchiti possono essere utilizzati per applicazioni a valle, come la caratterizzazione delle proteine, per comprendere le vie di segnalazione cellulare coinvolte nella progressione del cancro alla prostata.

Protocol

1. Arricchimento di peptidi pY con biossido di titanio

1. Risospendere i fosfopeptidi essiccati in 200 μL di ACN al 50%, TFA allo 0,1%. Agitare e centrifugare a 10.000 x g per 30 s. Ripeti l'operazione 1 volta per risospenderli bene.
2. Preparazione delle perle di TiO₂ contenute in puntali con una capacità di 200 μL di campioni.
   1. Picchiettare delicatamente sul lato piccolo della punta per spostare il materiale verso quell'estremità. Sciacquare il puntale aggiungendo 200 μl di ACN al 100%, quindi capovolgere il puntale e muovere l'estremità più piccola per spostare il liquido verso il tappo.
   2. Usando una lama di rasoio, taglia l'estremità piccola della punta e posizionala su un tubo a basso legame proteico. (Evitare l'uso di tubi di polistirolo poiché il TiO₂ si attaccherà ai lati del tubo.) Rimuovere il tappo e inserire una micropipetta per estrarre l'ACN rimanente. Ripetere il lavaggio con 200 μL di ACN al 100%. Le perle di TiO₂ si trovano ora nel tubo a basso legame proteico per i passaggi successivi.
   3. Precondizionare TiO₂ con 500 μL di 100% ACN 2x. Pipetlo per miscelare le perle con il solvente. Centrifugatele a 100 x g per 1 min.
   4. Condizione: TiO₂ con 500 μL di tampone fosfato di sodio 0,2 M (pH ~7) 2x. Lavare le perle con 300 μL di tampone di equilibrazione 3x. Poiché il TiO₂ è molto denso, le perle si depositeranno rapidamente.
3. Aggiungere 400 μl di ACN al 50%, TFA allo 0,1% nella provetta a basso legame proteico, quindi aggiungere 84 μl di acido lattico. Trasferire i fosfopeptidi risospesi nella provetta a basso legame proteico e incubarli per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un rotatore end-over-end.
4. Centrifugare le perle a 100 x g per 1 minuto per pellettizzarle. Lavarli con 300 μL di tampone di equilibrazione (Tabella 1) 2 volte e centrifugarli a 100 x g per 1 minuto.
5. Sciacquare le perle con 300 μL di tampone di risciacquo 2 volte. Trasferirle in un filtro centrifugo da 0,2 μm. Centrifugarli a 1.500 x g per 1 minuto.
6. Trasferire l'unità filtro in una provetta pulita da 1,5 ml a basso contenuto proteico. Eluire il contenuto 2 volte con 200 μL di 0,9% di NH₃ in H₂O. Misurare il pH con strisce di pH, che dovrebbe essere compreso tra 10 e 11. Concentrare sotto vuoto l'eluato per farlo asciugare durante la notte per far evaporare l'ammoniaca.

Tabella 1: Tamponi e soluzioni.Questa tabella mostra le composizioni dei tamponi e delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.

buffer	volume	composizione
Tampone di lisi del cloruro di guanidinio 6 M	50 ml	6 M di guanidinio cloruro, 100 mM tris pH 8,5, 10 mM di tris (2-carbossietil) fosfina, 40 mM di cloroacetammide, 2 mM di ortovanadato di sodio, 2,5 mM di pirofosfato di sodio, 1 mM di β-glicerofosfato, 500 mg di n-ottil-glicoside, acqua ultrapura a volume
100 mM di pirofosfato di sodio	50 ml	2,23 g di pirofosfato di sodio decaidrato, acqua ultrapura in volume
1M β-glicerofosfato	50 ml	15,31 g β-glicerofosfato, acqua ultrapura a volume
5% di acido trifluoroacetico	20 ml	Aggiungere 1 mL di acido trifluoroacetico al 100% in 19 mL di acqua ultrapura
Acido trifluoroacetico 0,1%	250 ml	Aggiungere 5 mL di acido trifluoroacetico al 5% a 245 mL di acqua ultrapura
tampone di eluizione pY	250 ml	0,1% acido trifluoroacetico, 40% acetonitrile, acqua ultrapura a volume
tampone di eluizione pST	250 ml	0,1% acido trifluoroacetico, 50% acetonitrile, acqua ultrapura a volume
Buffer di binding IP	200 ml	50 mM tris pH 7,4, 50 mM di cloruro di sodio, acqua ultrapura a volume
25 mM di bicarbonato di ammonio, pH 7,5	10 ml	Sciogliere 19,7 mg in 10 mL di acqua sterile ultrapura, pH a 7,5 con acido cloridrico 1 N (~10-15 μL/10 ml di soluzione), preparare fresco
1M tampone fosfato, pH 7	1.000 ml	423 mL di sodio diidrogeno fosfato 1 M, 577 mL di sodio 1 M idrogeno fosfato
Tampone di equilibratura	14 ml	6,3 mL di acetonitrile, 280 μL di acido trifluoroacetico al 5%, 1740 μL di acido lattico, 5,68 mL di acqua ultrapura
Tampone di risciacquo	20 ml	9 mL di acetonitrile, 400 μL di acido trifluoroacetico al 5%, 10,6 mL di acqua ultrapura
Soluzione per spettrometria di massa	10 ml	500 μL di acetonitrile, 200 μL di acido trifluoroacetico al 5%, 9,3 mL di acqua ultrapura
Buffer A	250 ml	5 mM di fosfato monopotassico (pH 2,65), 30% di acetonitrile, 5 mM di cloruro di potassio, acqua ultrapura a volume
Buffer B	250 ml	5 mM di fosfato monopotassico (pH 2,65), 30% di acetonitrile, 350 mM di cloruro di potassio, acqua ultrapura a volume
0,9% idrossido di ammonio	10 ml	300 μl di idrossido di ammonio al 29,42%, 9,7 ml di acqua ultrapura

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collettore vuoto	Restek	Codice 26080
Liofilizzante	Labconco	7420020
Concentratore a vuoto da banco CentriVap	Labconco	7810010
Rotatore end-over-end	ThermoFisher Scientifico	415110Q
lametta	Fisher Scientifico	620177
Unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-15	Millipore Sigma	UFC901024
Provette coniche Nunc 15 mL	ThermoFisher Scientifico	12-565-268
Filtro rotante Millipore da 0,2 μm	Millipore Sigma	UFC30GVNB
Provette Eppendorf a basso legame proteico	Eppendorf	22431081
anti-Fosfotirosina, Agarosio, Clone: 4G10	Millipore Sigma	Codice: 16101
Kit di analisi di peptidi	Termo Scientifico	Codice 23275
Acido trifluoracetico (TFA)	Fisher Scientifico	Codice: PI-28904
Acetonitrile (ACN)	Fisher Scientifico	A21-1
acido lattico	Sigma-Aldrich	69785-250ML
Idrossido di ammonio	Fisher Scientifico	A669S-500
Fosfato di potassio monobasico	Fisher Scientifico	BP362-500
cloruro di potassio	Fisher Scientifico	BP366-500
Cloruro di calcio diidrato	Fisher Scientifico	BP510-500
Tris Base	Fisher Scientifico	BP152-5
MonoTip	PolyLC Inc	TT200TIO.96