Arricchimento di fosfopeptidi a base di biossido di titanio: un metodo per l'isolamento selettivo di fosfopeptidi dalla libreria di peptidi

1. Arricchimento di peptidi pY con biossido di titanio

1. Risospendere i fosfopeptidi essiccati in 200 μL di ACN al 50%, TFA allo 0,1%. Agitare e centrifugare a 10.000 x g per 30 s. Ripeti l'operazione 1 volta per risospenderli bene.
2. Preparazione delle perle di TiO₂ contenute in puntali con una capacità di 200 μL di campioni.
   1. Picchiettare delicatamente sul lato piccolo della punta per spostare il materiale verso quell'estremità. Sciacquare il puntale aggiungendo 200 μl di ACN al 100%, quindi capovolgere il puntale e muovere l'estremità più piccola per spostare il liquido verso il tappo.
   2. Usando una lama di rasoio, taglia l'estremità piccola della punta e posizionala su un tubo a basso legame proteico. (Evitare l'uso di tubi di polistirolo poiché il TiO₂ si attaccherà ai lati del tubo.) Rimuovere il tappo e inserire una micropipetta per estrarre l'ACN rimanente. Ripetere il lavaggio con 200 μL di ACN al 100%. Le perle di TiO₂ si trovano ora nel tubo a basso legame proteico per i passaggi successivi.
   3. Precondizionare TiO₂ con 500 μL di 100% ACN 2x. Pipetlo per miscelare le perle con il solvente. Centrifugatele a 100 x g per 1 min.
   4. Condizione: TiO₂ con 500 μL di tampone fosfato di sodio 0,2 M (pH ~7) 2x. Lavare le perle con 300 μL di tampone di equilibrazione 3x. Poiché il TiO₂ è molto denso, le perle si depositeranno rapidamente.
3. Aggiungere 400 μl di ACN al 50%, TFA allo 0,1% nella provetta a basso legame proteico, quindi aggiungere 84 μl di acido lattico. Trasferire i fosfopeptidi risospesi nella provetta a basso legame proteico e incubarli per 1 ora a temperatura ambiente utilizzando un rotatore end-over-end.
4. Centrifugare le perle a 100 x g per 1 minuto per pellettizzarle. Lavarli con 300 μL di tampone di equilibrazione (Tabella 1) 2 volte e centrifugarli a 100 x g per 1 minuto.
5. Sciacquare le perle con 300 μL di tampone di risciacquo 2 volte. Trasferirle in un filtro centrifugo da 0,2 μm. Centrifugarli a 1.500 x g per 1 minuto.
6. Trasferire l'unità filtro in una provetta pulita da 1,5 ml a basso contenuto proteico. Eluire il contenuto 2 volte con 200 μL di 0,9% di NH₃ in H₂O. Misurare il pH con strisce di pH, che dovrebbe essere compreso tra 10 e 11. Concentrare sotto vuoto l'eluato per farlo asciugare durante la notte per far evaporare l'ammoniaca.

Tabella 1: Tamponi e soluzioni.Questa tabella mostra le composizioni dei tamponi e delle soluzioni utilizzate in questo protocollo.