Modellazione del cancro alla prostata in modelli murini geneticamente modificati: una tecnica di editing genico localizzato mediata da CRISPR/Cas9 nelle cellule del lobo prostatico anteriore del topo

Abstract

Fonte: Riedel, M. et al. Somministrazione di virus di guide CRISPR alla prostata murina per l'alterazione genica. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive un metodo per modificare geni specifici nelle cellule della ghiandola prostatica utilizzando un sistema di somministrazione basato su adenovirus. L'approccio consente l'alterazione ortotopica e localizzata dell'espressione genica utilizzando la tecnologia CRISPR per sviluppare nuovi modelli murini per il cancro alla prostata.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Somministrazione di virus alla prostata murina

1. Anestetizzare l'animale mediante iniezione intraperitoneale con una siringa sterile da 1 ml e un ago da 27 G x 1/2". Utilizzare una dose di anestesia di 0,01 ml/g di peso corporeo. Se la procedura dura più di 30 minuti, mantenere l'anestesia iniettando 1/3 della dose iniziale ogni 30 minuti.
2. Esaminare la profondità dell'anestetico valutando il rilassamento muscolare, il ritiro del pedale e i riflessi palpebrali. Quando si osserva una perdita di riflessi, radere il basso addome dell'animale.
3. Coprire accuratamente gli occhi dell'animale con un unguento oftalmico veterinario utilizzando un batuffolo di cotone sterile per prevenire la cecità dovuta alla mancanza di riflesso corneale.
4. Pulire l'addome rasato con etanolo al 70% e iodio povidone al 10% per disinfettare l'area chirurgica. Strofinare l'area chirurgica dal centro dell'area chirurgica verso la periferia.
5. Eseguire un'incisione cutanea verticale sulla linea mediana addominale inferiore di circa 1 cm utilizzando una forbice chirurgica sterile.
6. Sollevare il peritoneo usando una pinza a punta fine per evitare di danneggiare gli organi che si trovano sotto. Praticare con cura un'incisione di <8 mm utilizzando le forbici chirurgiche attraverso il peritoneo.
   NOTA: A differenza degli esseri umani, la ghiandola prostatica di un roditore comprende quattro lobi separati. Il lobo anteriore è attaccato alla vescicola seminale.
7. Sposta delicatamente il tessuto adiposo per scoprire la vescicola seminale. Utilizzando una pinza ad anello, sollevare con cautela la vescicola seminale fino a identificare la prostata anteriore (Figura 1).
8. Iniettare un volume totale di 30 μL di soluzione virale (3 particelle virali da 10¹⁰) nell'epitelio prostatico anteriore utilizzando una siringa da insulina da 0,5 ml con ago da 30 G x 8 mm. Ridurre al minimo le perdite e assicurarsi che il fluido venga assorbito all'interno del tessuto, formando una piccola bolla. Riposizionare la vescicola seminale nella cavità addominale.
9. Sutura il peritoneo con 2-3 semplici punti interrotti utilizzando suture 6-0 riassorbibili con un cerchio di 13 mm, 3/8 e un ago a punta conica.
10. Pinzare la pelle con tre clip sterili da 4,8 x 6,5 mm che sollevano la pelle con una pinza per evitare di danneggiare il peritoneo.
11. Per un migliore recupero, applicare l'antidoto per anestesia in una dose di 0,01 ml/g di peso corporeo mediante iniezione intraperitoneale utilizzando una siringa sterile da 1 ml e un ago da 27 g x 1/2". Rimetti con cura l'animale nella sua gabbia.

Risultati

Figura 1: Illustrazione della procedura. La procedura viene eseguita nel topo Rosa26-LSL-Cas9-EGFP generato da Platt et al. La prostata anteriore (AP) è attaccata alla vescicola seminale (SV). Le particelle virali che esprimono l'RNA guida e una proteina Cre vengono iniettate nella prostata anteriore per alterare l'espressione genica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J topi	Il laboratorio Jackson	Codice 26175
Siringa da insulina U-100 da 0,5 ml	Bd	324825	per iniezione di virus
Siringa da 1 ml	Bd	300013	per iniezione di anestesia
Ago da 30 G 1/2''	Bd	Codice 304000	per iniezione di anestesia
Sutura 6-0 in polisorbo	Medtronic	GL889	per chiudere il peritoneo
Telo chirurgico sterilizzato monouso	Fornitori multipli
termoforo	Fornitori multipli
Tampone per la preparazione dello iodio povidone	Fisher Scientifico	06-669-70
Rifilatrice	Esculap	GT415	per radersi l'addome
Pinze Dumont	F.S.T	Codice 11252-00
Halsey Micro Porta Aghi	F.S.T	Codice: 12500-12
Forbici per iride	F.S.T	Codice 14094-11
Pinze a modello stretto	F.S.T	Codice 11002-12
Pinze ad anello	F.S.T	Codice 11106-09
Impugnatura con sistema a clip avvolta incl. Clip	F.S.T	Codice 12030-01	per chiudere la pelle
Dispositivo di rimozione del sistema di clip per ferite	F.S.T	Codice 12030-04
1x PBS	Gibco	Codice 10010-023
Antiberlina			ottenuto dalla struttura per animali
Butorfanolo			ottenuto dalla struttura per animali
Medetomidinacloridrato			ottenuto dalla struttura per animali
Midazolam			ottenuto dalla struttura per animali
100% etanolo	Fisher Scientifico	Codice 22-032-103
Unguento per gli occhi	Takeda	Codice: 7242
Virus (AAV, AV)	Fornitori multipli		Il virus utilizzato in questo protocollo è di produzione interna