Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Prepara le Soluzioni
- Preparare 1 L di soluzione di Bicarbonato di Krebs-Ringer (KRB) contenente 120,35 mM di NaCl, 5,9 mM di KCl, 15,5 mM di NaHCO3, 1,2 mM di Na2HPO 4,1,2 mM di MgCl2, 11,5 mM di glucosio e 2,5 mM di CaCl2. Il giorno dell'uso, mantenere la soluzione KRB su ghiaccio.
nota: Il KRB può essere conservato a 4 °C per un massimo di una settimana e deve essere pre-bollito con una miscela di 97% di O2 e 3% di CO2 per almeno 10 minuti prima dell'uso.
2. Sezione del Vibratomo del Rene
- Usa una pinza smussata per afferrare e rimuovere delicatamente il rene preparato dalla soluzione di KRB ghiacciata. Posizionare immediatamente il rene su carta assorbente per ~2-4 s per rimuovere l'umidità esterna in eccesso. Far rotolare delicatamente il rene sulla carta assorbente per assicurarsi che tutti i lati del parenchima si siano asciugati in modo che vi sia un'adesione ottimale del rene allo stadio di vibratomo.
NOTA: Poiché la pelvi renale si trova all'interno del rene e quindi protetta dal parenchima esterno, questo breve periodo di asciugatura non sarebbe dannoso per l'integrità dei tessuti.
- Applicare immediatamente uno strato sottile di colla cianoacrilica (~1 cm2) alla base della piastra del campione di vibratomo e utilizzare una pinza smussata per posizionare il rene, con l'uretere rivolto verso il basso, sull'area ricoperta di colla. Applicare delicatamente una pressione verso il basso sulla parte superiore del rene con il bordo piatto della pinza per circa 10-20 s per asciugare la colla.
nota: Per stabilizzare il rene durante questa procedura, utilizzare un paio di pinze aggiuntive per mantenere il rene in posizione verticale mentre la colla si asciuga. È fondamentale che il rene aderisca alla piastra del campione in posizione verticale in modo che le sezioni siano tagliate dritte. Per assicurarsi che il rene abbia aderito correttamente alla piastra del campione, spingere delicatamente il lato del rene. Se il rene ha aderito con successo alla placca, la base del rene deve rimanere fissata alla piastra.
- Fissare saldamente la piastra del campione sul fondo del vassoio tampone. Regolare il livello della soluzione di KRB in modo che la parte superiore del rene sia completamente immersa. Durante le fasi di sezionamento, man mano che la lama del vibratomo si sposta più in profondità nel vassoio del tampone, rimuovere la soluzione KRB in modo che il portalama non venga immerso nella soluzione.
nota: Se la colla non si è completamente asciugata prima di procedere con questo passaggio, la colla spesso si sposterà dalla base al parenchima renale. Questa colla in eccesso renderà il sezionamento più variabile. Se ciò accade, rimuovere il rene dal piatto e procedere con una preparazione di rene fresco.
- Per il sezionamento automatico del vibratomo, selezionare le posizioni di inizio e fine del ciclo di taglio della lama del vibratomo. Verificare che queste posizioni siano distanti ~0,5–1 cm dal rene per garantire che ad ogni avanzamento della lama, l'intero piano renale venga sezionato.
- Preparare una piastra a più pozzetti (24 o 48 pozzetti) riempiendo i pozzetti con una soluzione di KRB e posizionare la piastra sul ghiaccio.
nota: Una volta generate, le singole sezioni devono essere posizionate in pozzetti separati per tenere traccia della profondità della sezione.
- Avviare il processo di taglio automatico. Durante il passaggio iniziale della lama, assicurarsi che la lama entri in contatto con la parte superiore del rene. Se il contatto non viene effettuato, regolare la posizione Z iniziale della lama.
- Usando il forcipe, raccogli le sezioni che vengono liberate dal rene. Trasferire immediatamente le sezioni nei singoli pozzetti e annotare la profondità Z delle sezioni per valutare la posizione approssimativa della PKJ all'interno delle sezioni renali.
nota: A seconda dei parametri di taglio, alcune sezioni potrebbero non essere tagliate dal blocco renale. In tal caso, utilizzare con attenzione le forbici a molla fine per tagliare le sezioni dal blocco renale. Gli utenti sono inoltre incoraggiati a visualizzare attivamente le sezioni al microscopio ottico mentre galleggiano liberamente nei singoli pozzetti per garantire impostazioni di taglio e posizione ottimali del tessuto. Le sezioni contenenti la PKJ saranno tipicamente derivate ~ 1000-1500 μm dalla parte superiore del rene.
- Continuare il protocollo di sezionamento fino a quando le regioni PKJ diventano più evidenti. Fare riferimento alla sezione dei risultati rappresentativi per una descrizione delle regioni PKJ man mano che il sezionamento procede.
- A questo punto, ottimizzare i parametri di sezionamento per garantire che le sezioni vengano liberate dal blocco renale in modo uniforme e siano integre. Inoltre, assicurarsi che le regioni PKJ siano continue e ininterrotte perché le pareti PKJ rotte non consentiranno un'adeguata imaging delle cellule all'interno della parete a causa del collasso. Se le pareti si rompono, diminuire la velocità di sezionamento e aumentare lo spessore della sezione e continuare a osservare le sezioni al microscopio ottico per mettere a punto i parametri di taglio.
- Conservare le sezioni a 4°C in soluzione KRB fino all'inizio della sperimentazione.
