Modello di organoide tumorale della vescica: un metodo per il trapianto ortotopico di organoidi della vescica nella vescica murina ricevente

Abstract

Fonte: Kim, Y. et al. Coltura, manipolazione e trapianto ortotopico di organoidi tumorali della vescica di topo.J. Vis. Exp.(2020)

In questo video, descriviamo il trapianto ortotopico di organoidi tumorali vescicali in coltura nella vescica murina per studiare il ruolo dell'ambiente dell'organo sullo sviluppo dei tumori.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Organoidi Tumorali della Vescica della sottocoltura
 

NOTA: Si raccomanda il passaggio degli organoidi tumorali della vescica quando raggiungono i 100-150 μm di diametro.

1. Aggiungere 500 μl di collagenasi/dispasi al terreno dell'organoide in una piastra a 24 pozzetti con organoidi tumorali. Pipettare su e giù per la matrice della membrana basale e il terreno. Incubare per 20 minuti a 37 °C e raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL.
   nota: Esaminare al microscopio gli organoidi isolati dalla matrice della membrana basale. Se gli organoidi non sono staccati dalla matrice della membrana basale, aumentare il tempo di incubazione o pipettare più volte.
2. Aggiungere 5 mL di DMEM preriscaldato, centrifugare la provetta a 400 x g per 3 minuti a 4 °C e aspirare il surnatante.
3. Risospendere il pellet utilizzando 1 mL di tripsina-EDTA preriscaldata allo 0,25% e 10 μM di Y-27632. Incubare per 5 minuti a bagnomaria a 37 °C. Pipettare energicamente le cellule su e giù e neutralizzare la tripsina utilizzando 5 ml di DMEM con il 10% di FBS.
4. Centrifugare la provetta a 400 x g per 3 minuti a 4 °C e aspirare il surnatante.
5. Risospendere il pellet utilizzando 1 mL di terreno organoide preriscaldato e contare il numero di singole cellule tumorali.

2. Trapianto ortotopico di organoide vescicale (Figura 1A)

1. Preparare gli organoidi tumorali della vescica per il trapianto ortotopico
   1. Prima del trapianto, coltivare gli organoidi tumorali della vescica per 5-7 giorni, come descritto sopra.
   2. Aggiungere 500 μl di collagenasi/dispasi al terreno dell'organoide in una piastra a 24 pozzetti con gli organoidi tumorali. Pipettare su e giù per la matrice della membrana basale e il terreno. Incubare per 20 minuti a 37 °C e raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL.
   3. Aggiungere 5 mL di DMEM preriscaldato, centrifugare la provetta a 400 x g per 3 minuti a 4 °C e aspirare il surnatante.
   4. Risospendere il pellet con 1 mL di DMEM e trasferire la soluzione in una piastra di Petri da 90 mm.
   5. Al microscopio, prelevare i 10-100 organoidi tumorali utilizzando una micropipetta P200 e raccoglierli in una microprovetta su ghiaccio.
   6. Centrifugare la provetta a 400 x g per 3 minuti a 4 °C ed eliminare con cura il surnatante.
   7. Mantenere il pellet cellulare sul ghiaccio fino a quando i topi non sono pronti per l'intervento chirurgico.
2. Trapianto di parete vescicale sottomucosa
   1. Preparare un topo nudo maschio di 8-10 settimane (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) almeno 1 settimana prima dell'esperimento per consentirgli di acclimatarsi a un nuovo ambiente. Iniettare enrofloxacina (5 mg/kg) per via sottocutanea 24 ore prima dell'intervento chirurgico.
   2. Pulire la superficie del banco con acqua e sapone. Autoclavare gli strumenti chirurgici prima della procedura chirurgica ed eseguire l'intervento chirurgico utilizzando strumenti sterili.
   3. Tenere la siringa da insulina da 29 G, i puntali delle pipette e la matrice della membrana basale sul ghiaccio. Somministrare ketoprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea prima della somministrazione dell'anestesia.
   4. Anestetizzare il topo con isoflurano al 4% in una camera di induzione. Una volta ottenuta l'anestesia generale, adagiare il topo in posizione supina e mantenere l'anestesia mediante inalazione con maschera di isofluran>nota: Se il tempo di anestesia è superiore a 30 minuti, applicare un unguento oculare su entrambi gli occhi utilizzando un batuffolo di cotone per evitare l'essiccazione della cornea.
   5. Applicare lo iodio povidone con una garza sterile e strofinare con etanolo al 70%. Ripetere 3 volte con una nuova garza o un batuffolo di cotone ogni volta.
   6. Coprire l'ano e il campo chirurgico utilizzando teli chirurgici sterili monouso.
   7. Utilizzando un microscopio da dissezione per l'ingrandimento, praticare una piccola incisione trasversale (più piccola di 1,5 cm) nella pelle e nella parete muscolare dell'addome della linea mediana inferiore con forbici chirurgiche sterili. Esporre la vescica dalla cavità addominale e sostenerla con tamponi di cotone imbevuti di soluzione salina.
      nota: Se la vescica è piena di urina, premere delicatamente la vescica per decomprimerla leggermente.
   8. Risospendere i pellet di organoidi in 80 μL di terreno organoidico contenente il 50% di matrice di membrana basale ad alta concentrazione (Tabella 1 e Tabella dei materiali).
   9. Iniettare la sospensione di organoidi nella faccia anteriore della cupola vescicale utilizzando la siringa da insulina da 29 G al microscopio da dissezione.
   10. Chiudere lo strato interno della parete addominale con sutura riassorbibile antibatterica e quindi chiudere lo strato esterno con sutura in nylon 4-0. Disinfettare il sito chirurgico con iodio povidone ed etanolo al 70%.
   11. Lasciare che il mouse si riprenda sotto un irradiatore a infrarossi per 10-15 minuti. Monitorare il mouse fino a quando non riprende conoscenza e motilità.
   12. Un giorno dopo l'intervento, controllare le condizioni generali del topo e la perdita anastomotica. Somministrare ketoprofene (5 mg/kg) una volta al giorno per 3 giorni dopo l'intervento e trattare l'enrofloxacina (5 mg/kg) una volta al giorno per 10 giorni dopo l'intervento.
   13. Quando il sito dell'incisione è guarito (10-14 giorni dopo l'intervento), rimuovere i punti di sutura. Monitorare la crescita del tumore della vescica di topo per 2-3 settimane dopo l'iniezione dell'organoide tumorale.
   14. Se si osserva una crescita del tumore della vescica, sopprimere il topo utilizzando l'inalazione di anidride carbonica e raccogliere l'intero tumore della vescica. Lavarlo con DPBS freddo (Figura 1B).
   15. Per analizzare l'istologia del tumore della vescica, colorare la sezione del tessuto inclusa nella paraffina utilizzando la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) (Figura 1B).

Terreno organoide tumorale della vescica di topo
Advanced DMEM/F-12 (base media)	10 mM HEPES (pH 7,4)
10 mM di nicotinamide	0,5x integratore senza siero
2 mM di L-alanil-L-glutammina dipeptide	1% Penicillina/Streptomicina
1 mM di N-acetil-L-cisteina	50 ng/mL di fattore di crescita epidermico murino
1 μM A 83-01

Tabella 1: Composizione del mezzo organoide tumorale della vescica.

Risultati

Figura 1: Trapianto ortotopico di organoidi tumorali della vescica.(A) Diagramma schematico del trapianto ortotopico di organoidi tumorali della vescica su un topo nudo. (B) Immagini rappresentative di vesciche e sezioni colorate con H&E da topi trapiantati ortotopicamente con organoidi tumorali della vescica. Le viste ingrandite delle regioni in...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta conica da 15 mL	Spl	Codice: 50015
Piastra a 24 pozzetti	Corning	Codice: 3526
29 G 1/2 siringa da insulina	Shina	B299473538
Provetta conica da 50 mL	Spl	Codice: 50050
Codice: A8301	Tocris	Codice: 2939	Concentrazione stock: 25 mM
Etanolo assoluto	Daejung	4023-2304
Sutura riassorbibile	Henry Schein	Codice 039010
DMEM/F-12 avanzato	termo	12634028
CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (topo nudo)	Fiume Carlo	194
Collagenasi tipo I	termo	17100017	Concentrazione di riserva: 20 mg/mL
Collagenasi tipo II	termo	17100015	Concentrazione di riserva: 20 mg/mL
Collagenasi/dispasi	sigma	10269638001	Concentrazione di riserva: 1 mg/mL
DMEM (Dulbecco's modified minimum essential media)	Gibco	Codice: 11965-118
DMSO (dimetilsolfossido)	sigma	D8418
DPBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco)	Welgene	LB 001-02
Fattore di crescita Matrigel ridotto (GFR) Fattore di crescita ridotto (GFR)	Corning	Codice 354230	Utilizzare per la coltura di organoidi in piastra
Matrigel ad alta concentrazione (HC)	Corning	354248	Utilizzo per il trapianto di organoidi
Microprovetta da 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
lametta
Tampone salino	JW Farmaceutico
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200072
Provetta per ultracentrifugazione	Beckman Coulter	331372
Y-27632 dicloridrato	Abmole	Visualizzazione del materiale M1817	Concentrazione stock: 10 mM