Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Preparazione delle sonde
- Preparare sonde in lega di titanio-nichel (lunghezza 40 mm; diametro 0,2 mm) rivestite con assorbente in modalità mista da 7 mm. Il numero di sonde dipende dai punti temporali presi di mira durante l'intera procedura e dal numero di repliche (si consiglia 3 per punto temporale).
nota: La durata e il tipo di fase di estrazione possono essere regolati in base alla modalità di studio, alla polarità dei metaboliti e alla matrice del campione.
- Preparare una miscela detergente composta da cloroformio:metanolo 2:1 (v/v). Pipettare 1,0 mL di soluzione in ogni flaconcino di vetro da 2,0 mL e posizionare una sonda, precedentemente perforata attraverso il tappo, in ogni flaconcino.
nota: Prima dell'uso, pulire tutte le sonde per rimuovere le particelle contaminanti.
- Mettere le fiale sull'agitatore e impostare la velocità di agitazione a 1.200 giri/min. Dopo 45 minuti, arrestare il dispositivo e risciacquare i rivestimenti con acqua di grado LC-MS.
- Poiché i rivestimenti devono essere sottoposti a una fase di precondizionamento per attivarli, preparare una miscela di precondizionamento composta da metanolo 1:1:acqua (v/v). Pipettare 1,0 mL di soluzione in ogni flaconcino di vetro da 2,0 mL e posizionare una sonda, precedentemente perforata attraverso il tappo, in ciascun flaconcino.
- Mettere le fiale sull'agitatore a vortice e impostare la velocità di agitazione a 1.200 giri/min.
- Dopo 60 minuti, arrestare l'agitatore e risciacquare i rivestimenti con acqua di grado LC-MS.
- Sterilizzare le sonde secondo il protocollo standard di sterilizzazione delle apparecchiature chirurgiche.
2. Estrazione
- Aprire la confezione sterile subito prima del campionamento per garantire un ambiente sterile.
- Inserire due sonde direttamente nella corteccia renale per 10 minuti in ogni momento. L'intera lunghezza del rivestimento deve essere coperta dalla matrice tissutale; Non è richiesto un angolo specifico, ma di solito si utilizzano circa 90 gradi.
nota: L'intera procedura medica segue i protocolli standard di un determinato istituto. Non sono prese in considerazione modifiche relative al campionamento SPME. La procedura prevede i seguenti sei punti temporali di campionamento: a) prima della resezione renale, in vivo da donatore; b)–e) dopo 1 ora, 3 ore, 5 ore, 7 ore di perfusione renale, ex vivo in camera d'organo; f) dopo riperfusione, in vivo dal ricevente.
- Ritrarre le sonde estraendole dal tessuto, quindi risciacquare i rivestimenti con acqua di grado LC-MS per eliminare il sangue residuo dalla superficie del rivestimento. Sciacquare lontano dal sito chirurgico e subito dopo la rimozione delle sonde.
3. Trasporto e stoccaggio
- Posizionare le sonde in fiale separate e chiuderle.
- Mettere le fiale in una scatola di polistirolo riempita con ghiaccio secco o in azoto liquido per il trasporto.
- Conservare i campioni in un congelatore (-80 °C) o iniziare immediatamente la fase di desorbimento.
4. Desorbimento
- Preparare soluzioni di desorbimento composte da acetonitrile:acqua (v/v) 80:20 per l'analisi metabolomica e isopropanolo:metanolo 1:1 (v/v) per l'analisi lipidomica.
- Pipettare 100 μL della soluzione in inserti inseriti in flaconcini marcati da 2,0 mL e posizionare una sonda, precedentemente perforata attraverso il tappo, in ciascun flaconcino.
- Mettere le fiale sull'agitatore a vortice e impostare la velocità di agitazione a 1.200 giri/min per 120 minuti.
- Rimuovere le sonde dalle fiale. Gli estratti ottenuti sono ora pronti per l'analisi strumentale.
5. Analisi LC-MS
- Inserire le fiale contenenti estratti nell'autocampionatore del sistema LC-MS.
nota: Per questo studio sono stati utilizzati cromatografia liquida (RP, HILIC) abbinata a spettrometria di massa ad alta risoluzione e un analizzatore di massa orbitrap. Per i parametri dell'analisi metabolomica, andare al passaggio 5.2. Per i parametri dell'analisi lipidomica, andare al passaggio 5.6.
- Utilizzare una colonna di pentafluorofenile (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 μm) per la separazione in fase inversa.
- Impostare la portata a 300 μl/min e le temperature dell'autocampionatore e della colonna rispettivamente a 4 °C e 25 °C.
- Preparare le fasi mobili secondo le seguenti proporzioni: fase mobile A: acqua: acido formico (99,9:0,1, v/v) e fase mobile B: acetonitrile:acido formico (99,9:0,1, v/v). Impostare il flusso di fase mobile in base ai seguenti parametri: avvio del flusso di fase mobile (0-3 min): 100% A seguito da un gradiente lineare fino al 10% A (3-25 min), terminazione con il flusso isocratico del 10% A fino a 34 min, seguito da 6 min di tempo di riequilibrio della colonna.
- Per la separazione HILIC, utilizzare una colonna HILIC (2,0 mm x 100 mm, 3 μm, 200 A). Impostare la portata su 400 μL/min.
- Preparare le fasi mobili secondo le seguenti proporzioni: fase mobile A: acetonitrile:tampone acetato di ammonio (9:1, v/v, concentrazione efficace di sale 20 mM), fase mobile B: tampone acetonitrile:acetato di ammonio (1:1, v/v, concentrazione efficace di sale 20 mM).
- Impostare il flusso di fase mobile in base ai seguenti parametri: avviare il flusso di fase mobile (0-3 min) al 100% A, mantenere premuto per 3,0 min e quindi rampare al 100% B entro 5 min. Tenere premuto con 100% B fino a 12 min, seguito da 8 min di tempo di riequilibrio della colonna.
- Impostare l'intervallo di scansione su 85–1000 m/z. Impostare i parametri della sorgente ionica HESI in modalità ionizzazione positiva su: tensione di spruzzo 1.500 V, temperatura capillare 300 °C, gas guaina 40 u.a., portata di gas ausiliario 15 u.a., temperatura riscaldatore sonda 300 °C, livello RF S-Lens 55%.
- Eseguire campioni di controllo qualità composti da 10 μl di ciascun campione analizzato (regolarmente, ogni 10-12 campioni) per monitorare le prestazioni dello strumento.
- Per la separazione in fase inversa, utilizzare una colonna C18 (2,1 mm x 75 mm, 3,5 μm).
- Impostare la portata a 200 μl/min e le temperature dell'autocampionatore e della colonna rispettivamente a 4 °C e 55 °C. Preparare le fasi mobili secondo le seguenti proporzioni: fase mobile A: H2O:MeOH (60: 40, v/v), 10 mM di acetato di ammonio e 1 mM di acido acetico; fase mobile B: IPA:MeOH (90:10, v/v), 10 mM di acetato di ammonio e 1 mM di acido acetico.
- Impostare il flusso di fase mobile in base ai seguenti parametri: 0–1 min (20% B), 1–1,5 min (20–50% B), 1,5–7,5 min (50–70% B), 7,5–13 min (70–95% B), 13–17 min (95% B), 17–17,1 min (95–20% B), 17,1–23 min (20%).
- Per la separazione HILIC, utilizzare una colonna HILIC (100 x 2,1 mm, 3 μm).
- Impostare la portata a 400 μl/min e le temperature dell'autocampionatore e della colonna rispettivamente a 4 °C e 40 °C.
- Preparare le fasi mobili secondo le seguenti proporzioni: fase mobile A:ACN; fase mobile B: 5 mM di acetato di ammonio in acqua. Impostare il flusso di fase mobile in base ai seguenti parametri: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15,1 min (80-96% B), 15,1-21 min (96% B).
- Impostare i parametri della sorgente ionica HESI in modalità di ionizzazione positiva su tensione di spruzzatura 3.500 V, temperatura capillare 275 °C, gas guaina 20 u.a., portata del gas ausiliario 10 u.a., temperatura del riscaldatore della sonda 300 °C, livello RF S-Lens 55%.
- Eseguire campioni QC composti da 10 μl di ciascun campione analizzato (ogni 10-12 campioni) per monitorare le prestazioni dello strumento.
- Eseguire l'acquisizione dei dati in software compatibile con lo strumento.
6. Analisi dei dati
- Eseguire l'elaborazione dei dati, l'identificazione putativa e l'analisi statistica utilizzando software dedicati alla metabolomica non mirata e all'analisi lipidomica.
nota: Per visualizzare la struttura dei dati è possibile ottenere l'analisi delle componenti principali (PCA) e i grafici a scatola.
