Colorazione del DNA extracellulare: un metodo per identificare il DNA extracellulare nelle sezioni di tessuto FFPE

Abstract

Fonte: O'Sullivan, K. M. et al. Apprendimento automatico supervisionato per la semi-quantificazione del DNA extracellulare nella glomerulonefrite. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video descrive la tecnica di colorazione del DNA extracellulare in sezioni di tessuto FFPE. Il DNA extracellulare colorato può essere quantificato per determinare l'efficacia di qualsiasi trattamento terapeutico che porta alla morte delle cellule tumorali.

Protocollo

1. Colorazione per ecDNA con DAPI e β-actina

1. Mettere i vetrini in una griglia per vetrini in forno a 60 °C per 60 minuti.
2. Immergere i vetrini in due cambi di solvente (xilene o sostituto) per 40 minuti ciascuno, in una cappa aspirante.
3. Reidratare i vetrini in etanolo al 100%, etanolo al 100% ed etanolo al 70% per 5 minuti ciascuno. Lavare per 5 minuti in acqua di rubinetto.
4. Mettere una piastra calda in una cappa aspirante e far bollire la soluzione di recupero dell'antigene (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) in una pentola a pressione. Non appena la soluzione per il recupero dell'antigene inizia a bollire, posizionare i vetrini nella pentola orizzontalmente usando un paio di pinze e bloccare il coperchio. Far bollire alla massima potenza (equivalente a 15 psi o 103 kPa) per 10 min.
   nota: Questo passaggio è cruciale in quanto recupera l'antigene di interesse smascherando l'epitopo dell'antigene (reticolato tramite fissazione in formalina) per consentire il legame specifico dell'anticorpo dell'epitopo; La successiva colorazione non funzionerà senza di essa.
5. Togliere la pentola a pressione dal fuoco e rimuovere immediatamente il coperchio facendo scorrere il rubinetto freddo sulla parte superiore del coperchio di un lavandino. Lasciare equilibrare i vetrini per 20 minuti nella soluzione di recupero dell'antigene.
6. Lavare i vetrini due volte per 5 minuti in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 0,01 M (pH 7,4) su un agitatore orbitale.
7. Usa una penna idrofobica per disegnare cerchi attorno al tessuto renale, facendo attenzione a non lasciare che il tessuto si secchi in questo tempo.
8. Bloccare il tessuto in siero di pollo al 10% in albumina sierica bovina al 5% (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) per 30 minuti, 60 μL per sezione. Non lavare dopo questo passaggio, ma rimuovere con cura la soluzione bloccante utilizzando una pipetta da 60 μl, non lasciare che le sezioni si secchino.
9. Applicare il cocktail di anticorpi primari per β-actina diluito 1/1000 in 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 μl per sezione e incubare per una notte in una camera di umidità a 4 °C.
10. Lavare i vetrini due volte per 5 minuti in PBS (pH 7,4, 0,01 M) su un agitatore orbitale.
11. Applicare l'anticorpo secondario, pollo anti-coniglio 488 (1/200), 60 μl per sezione diluita in 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) per 40 minuti a RT.
12. Lavare i vetrini due volte per 5 minuti in PBS (pH 7,4, 0,01 M) su un agitatore orbitale.
13. Immergere i vetrini in Sudan Black 0,3% in etanolo al 70% per 30 minuti in un barattolo Coplin.
    nota: Questo passaggio è importante in quanto spegne l'autofluorescenza causata dalla fissazione della formalina.
14. Lavare i vetrini in acqua di rubinetto per rimuovere il precipitato e quindi immergerli in PBS (pH 7,4, 0,01 M) per 10 minuti per evitare la formazione di ulteriore precipitato di Sudan Black.
15. Montare i vetrini sui vetrini coprioggetti confocali utilizzando tre gocce da 60 μL di soluzione di montaggio con DAPI e sigillare i vetrini coprioggetti con smalto per unghie applicandoli lungo il perimetro del vetrino coprioggetti.
16. Lasciare indurire i vetrini per 24 ore a RT (per consentire la penetrazione del DAPI) e quindi conservare a 4 °C al riparo dalla luce.
    nota: Importante da tenere al buio per evitare lo sbiadimento delle sonde fluorescenti.
17. Diapositive di immagini utilizzando una testa di scansione laser confocale collegata a un microscopio. Emoziona i vetrini con il laser 405 per DAPI e il laser 488 per Beta Actina. Acquisisci immagini su un singolo piano da 1024 x 1024 pixel utilizzando l'acquisizione sequenziale in linea e la media a 4 linee, essenziale per rilevare l'ecDNA. Viene utilizzato un obiettivo dell'olio 40x 1.0 NA.
    1. Visualizzare un minimo di 20 glomeruli per campione. Salva le immagini come file ND2.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina sierica bovina	sigma	Codice A2153	Le soluzioni al 5% e all'1% sono costituite da PBS, possono essere prodotte alla rinfusa e congelate - scartare una volta scongelate
Pollo anti capra IgG (H+L) anticorpo assorbito incrociato Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientifico	A-21468	Centrifugare la mini centrifuga per 1 minuto prima dell'uso per evitare qualsiasi coniugato libero nel cocktail di anticorpi
Anticorpo ad assorbimento incrociato IgG (H+L) di pollo anti topo, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientifico	Codice A-121468	Centrifugare la mini centrifuga per 1 minuto prima dell'uso per evitare qualsiasi coniugato libero nel cocktail di anticorpi
Pollo anti coniglio IgG (H+L) anticorpo assorbito dall'incrocio Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientifico	A-21441	Centrifugare la mini centrifuga per 1 minuto prima dell'uso per evitare qualsiasi coniugato libero nel cocktail di anticorpi
Sieri di pollo	sigma	Codice: C5405	Composto da 1% BSA/PBS
Vetrini coprioggetti 24x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Questo non è uno spessore standard progettato per l'uso in microscopia confocale
EDTA 10mM	sigma	E6758	Aggiungere TRIS e EDTA insieme in acqua distillata e il pH a 9, per il recupero dell'antigene, può essere preparato in una soluzione 10x
Etanolo 30%, 70% e 100%	Fornitura chimica	UN1170	Fornito come etanolo non denaturato al 100% - diluito al 30% e al 70% con acqua distillata
Formaldeide, 4% (10% Formalina tamponata neutra)	Traiano	Pannello NBF-500	Il rene viene inserito in un tubo da 5 ml contenente 3 ml di formalina per 16 ore a RT, la formalina deve essere utilizzata in una cappa aspirante
Vetrini istologici in vetro - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1,0 mm	Traiano	J3800AM4	L'uso di vetrini rivestiti con carica positiva è essenziale. Si sconsiglia l'uso di poli-L-lisina per il rivestimento dei vetrini poiché il tessuto si stacca dai vetrini durante la fase di recupero dell'antigene
Anticorpo MPO anti-uomo/topo di capra	Ricerca e Sviluppo	AF3667	Aliquotare e congelare a meno 80 gradi all'arrivo
Penna idrofobica	Laboratori VECTOR	H-400	Utilizzare per disegnare un cerchio attorno al tessuto renale
Soluzione salina tamponata con fosfato	sigma	P38135	0,01 milioni di PB/0,09% NaCl Composizione 5 litri alla volta
Pentola a pressione 6L Tefal secure 5 Neo inox	Tefal	GSA-P2530738	Acquistato presso il negozio di articoli per la casa locale
Prolunga l'oro DAPI	Tecnologie per la vita	P36962	Applicare le gocce direttamente sul vetrino coprioggetti
Coniglio anti umano/topo Anticorpo Beta Actina	ABCAM	ab8227	Aliquotare e congelare a meno 80 gradi all'arrivo
Anticorpo H3Cit anti-umano/topo di coniglio	ABCAM	AB5103	Aliquotare e congelare a meno 80 gradi all'arrivo
Rack di colorazione 24 vetrini	ProScitech	H4465	Il rack di colorazione scelto deve essere in grado di resistere all'ebollizione sotto pressione e all'incubazione in forno a 60 gradi
Sudan Nero B	sigma	199664	0,3% Aggiungere 3 g in una bottiglia da 1 litro in etanolo al 70%, filtrare e proteggere dalla luce - stabile per 6 mesi a temperatura ambiente
Tris 10mM	sigma	T4661	Aggiungere TRIS e EDTA insieme in acqua distillata e il pH a 9, per il recupero dell'antigene, può essere preparato in una soluzione 10x
xilene	Traiano	XL005/20	Deve essere utilizzato in una cappa aspirante