Derivazione di podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte: una procedura per la differenziazione diretta di podociti renali maturi da cellule staminali

Abstract

Fonte: Burt, M. et al. Differenziazione Guidata di Podociti Renali Maturi da Cellule Staminali Pluripotenti Indotte Umane in Condizioni Chimicamente Definite. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, descriviamo il protocollo per derivare podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte attraverso la differenziazione cellulare in condizioni chimiche definite. I podociti generati possono essere utilizzati per i test di nefrotossicità e la modellazione delle malattie.

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

1. Diluire 5 terreni di coltura cellulare hiPS (CCM) scongelati in terreno basale di coltura cellulare hiPS per ottenere una soluzione 1x di hiPS CCM.
   nota: L'integratore congelato 5x hiPS CCM richiede un processo di scongelamento lento, idealmente a 4 °C per la notte. Le aliquote del 1x hiPS CCM possono essere conservate fino a 6 mesi a -20 °C.
2. Preparazione di piastre rivestite con matrice 1 a membrana basale (BM) per colture cellulari hiPS: scongelare la matrice BM 1 per una notte su ghiaccio a 4 °C. Una volta scongelate, preparare le aliquote con i fattori di diluizione appropriati come suggerito dal produttore.
   nota: Tipicamente, le aliquote vengono preparate per la successiva diluizione in 25 mL di DMEM/F12 freddo in una provetta conica da 50 mL seguita da un'accurata miscelazione per dissolvere completamente la matrice BM 1 ed evitare la formazione di cristalli residui.
3. Trasferire 1 mL della soluzione di matrice BM 1 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 1-2 ore o a 4 °C per un minimo di 24 ore, avvolto in una pellicola di paraffina. Le piastre rivestite BM matrix 1 possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
4. Preparazione delle piastre rivestite con matrice a membrana basale (BM) 2: diluire quantità appropriate di matrice BM 2 in 9 mL di acqua distillata sterile per preparare una concentrazione finale di 5 μg/mL. Aggiungere 700 μl della soluzione di matrice BM 2 a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore o per una notte a 4 °C.
5. Preparare 100 μg/mL di soluzioni madre di BMP7, Activina A e VEGF come segue: Ricostituire BMP7 in acqua distillata sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA e ricostituire separatamente l'Activina A e il VEGF in PBS sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA. Per evitare frequenti cicli di gelo-scongelamento, preparare aliquote da 100 μL da ciascuna soluzione madre e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
6. Preparare una soluzione madre da 10 mM di Y27632 sciogliendo 10 mg di Y27632 in 3,079 mL di acqua distillata sterile. Aliquotare 100 μL dal magazzino e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
7. Sciogliere 2 mg di CHIR99021 in 143,4 μl di DMSO sterile per preparare una soluzione madre da 30 mM. Preparare aliquote da 5 μl e conservare a -20 °C per un massimo di 1 mese (o secondo le raccomandazioni del produttore).
8. Sciogliere 10 mg di acido retinoico all-trans in 3,33 mL di DMSO sterile. Preparare aliquote da 500 μl e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.

2. Preparazione dei Terreni Culturali

1. Preparare il mezzo di differenziazione del mesoderma ricostituendo le corrispondenti soluzioni madre a una concentrazione finale di 100 ng/mL di activina A, 3 μM di CHIR99021, 10 μM di Y27632 e 1 integratore privo di siero di B27 in un volume appropriato di DMEM/12 con integratore di glutammina.
   nota: Il terreno di differenziazione del mesoderma deve essere preparato di fresco prima delle fasi di differenziazione e ad un volume appropriato per la scala dell'esperimento (tipicamente, 50 mL di terreno sono sufficienti per due piastre a 12 pozzetti).
2. Preparare il terreno intermedio di differenziazione del mesoderma ricostituendo le corrispondenti soluzioni madre a una concentrazione finale di 100 ng/mL di BMP7, 3 μM di CHIR99021 e 1x integratore privo di siero B27 in DMEM/F12 con un integratore di glutammina.
   nota: Se necessario, il terreno può essere integrato con penicillina-streptomicina all'1% (vol/vol). Regolare il volume del terreno utilizzando DMEM/F12 con integratore di glutammina. Questo mezzo può essere preparato in grandi lotti; tuttavia, si consiglia di conservare in aliquote più piccole (ad esempio, 45 mL in provette coniche da 50 mL) per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Questo terreno può essere conservato a -20 °C per un massimo di 3 mesi e può essere scongelato a 4 °C durante la notte prima dell'uso.
3. Preparare il terreno di induzione dei podociti ricostituendo a una concentrazione finale 100 ng/mL di BMP7, 100 ng/mL di activina A, 50 ng/mL di VEGF, 3 μM di CHIR99021, 1x integratore privo di siero B27 e 0,1 μM di acido all-trans retinoico in DMEM/F12 con integratore di glutammina. Proteggere il mezzo dalla luce (ad esempio, avvolgendo il contenitore con carta stagnola).
   nota: Questo terreno può essere preparato in grandi lotti e conservato al buio a -20 °C per un massimo di 3 mesi. Le aliquote congelate devono essere scongelate per una notte a 4 °C prima dell'uso.
4. Preparare 25 mL di soluzione neutralizzante della tripsina aggiungendo il 10% (vol/vol) di FBS inattivato a caldo in DMEM/F12 e filtrare in condizioni sterili.
5. Per il mantenimento post-differenziazione dei podociti derivati da cellule staminali, preparare il terreno completo con il terreno di mantenimento dei podociti aggiungendo l'integratore al terreno basale secondo le linee guida del produttore e conservare a 4 °C per un massimo di due settimane.

3. Coltura cellulare hiPS senza alimentatore utilizzando il terreno di coltura cellulare hiPS

1. Aspirare la soluzione residua della matrice BM 1 dalle piastre pre-rivestite e lavare i pozzetti 3 volte con 1-2 mL di DMEM/F12 riscaldato.
2. Aspirare il CCM hiPS esausto dalle celle hiPS e sciacquare le cellule 3 volte con DMEM/F12 riscaldato. Aggiungere 1 mL di soluzione calda per il distacco delle cellule e incubare per 1 minuto a 37 °C per aiutare a dissociare le cellule. Eseguire l'ispezione visiva delle cellule al microscopio per colture tissutali e assicurarsi che i bordi delle colonie cellulari appaiano arrotondati, quindi aspirare rapidamente la soluzione di distacco cellulare dalle cellule (assicurandosi che le colonie cellulari siano ancora attaccate alla piastra, anche se in modo lasco). Sciacquare delicatamente le cellule una volta con DMEM/F12 per rimuovere la soluzione di distacco delle cellule.
3. Aggiungere 3 mL di hiPS CCM alle cellule hiPS (in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) che sono state trattate con la soluzione di distacco cellulare. Raschiare le colonie utilizzando un sollevatore di cellule e pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per rimuovere le cellule che aderiscono liberamente. Lavare accuratamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule vengano raccolte.
   nota: Si consiglia l'uso di una pipetta da 5 ml per evitare un taglio eccessivo sulle cellule.
4. Trasferire 0,5 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice BM 1 contenente 2 mL di CCM hiPS per pozzetto. Spostare la piastra a forma di otto per distribuire le colonie cellulari all'interno dei pozzetti e incubare a 37 °C in un incubatore al 5 % di CO₂. Rinfrescare il terreno ogni giorno fino a quando le cellule sono pronte per essere passate o utilizzate per l'esperimento di differenziazione (circa il 70 % di confluenza).
   nota: La dimensione ideale della colonia per il passaggio di routine delle iPSC è compresa tra 200 e 500 μm in condizioni prive di alimentatore utilizzando hiPS CCM (senza inibitore ROCK). Se le cellule vengono individualizzate durante il trattamento con enzimi di dissociazione o tamponi, l'hiPS CCM può essere integrato con un inibitore ROCK (ad es. 10 μM Y27632) per migliorare la vitalità cellulare.

4. Differenziazione delle cellule hiPS in cellule del mesoderma (giorni 0–2)

1. Mentre le colture cellulari hiPS sono nella fase di crescita esponenziale (circa entro 4 giorni dalla coltura dopo il passaggio e circa il 70% di confluenza), ispezionare visivamente la presenza di cellule spontaneamente differenziate all'interno e intorno ai bordi delle colonie. Se necessario, raschiare asetticamente le aree di differenziazione.
2. Aspirare l'hiPS CCM dalle cellule hiPS e sciacquare le cellule 3 volte con DMEM/F12 caldo. Incubare le cellule con 1 mL di tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi per 10 minuti a 37 °C e verificare la dissociazione al microscopio. A causa delle differenze intrinseche tra le diverse linee cellulari hiPS, il tempo di incubazione effettivo del tampone di dissociazione cellulare deve essere determinato per una data linea cellulare.
3. Raschiare delicatamente il pozzetto con un sollevatore di cellule per rimuovere le cellule che aderiscono in modo lasco e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL, quindi pipettare su e giù più volte per individualizzare le cellule hiPS.
   1. Portare la sospensione cellulare al volume di 15 mL con DMEM/F12 caldo e centrifugare per 5 minuti a 290 x g a temperatura ambiente.
   2. Aspirare delicatamente il surnatante e risospendere le cellule con DMEM/F12 caldo per un altro ciclo di centrifugazione per rimuovere i componenti residui della matrice BM 1 e del tampone di dissociazione.
4. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di induzione del mesoderma come descritto sopra. Contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di coltri per determinare il volume appropriato di terreno di differenziazione del mesoderma necessario per raggiungere una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule/mL.
5. Aspirare la soluzione ECM dalle piastre rivestite con matrice BM 2 e risciacquare le piastre due volte con DMEM/F12 caldo. Miscelare delicatamente la sospensione cellulare hiPS pipettandola alcune volte. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto delle piastre a 12 pozzetti rivestite con matrice BM a 2 pozzetti, quindi agitare delicatamente le piastre per distribuire le cellule in modo più uniforme.
6. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂. Aggiornare il mezzo di induzione del mesoderma il giorno successivo.
   nota: Dopo 2 giorni, le cellule del mesoderma derivate da cellule hiPS sarebbero pronte per l'induzione intermedia del mesoderma.

5. Differenziazione delle cellule del mesoderma derivate da cellule hiPS in mesoderma intermedio (giorni 2-16)

1. Il giorno 2 del protocollo di differenziazione, aspirare il terreno di induzione del mesoderma e rabboccare con 1 mL per pozzetto di terreno di induzione intermedio del mesoderma
.
2. Aggiornare il terreno ogni giorno per mantenere una soglia accurata di fattori di crescita e piccole molecole per le cellule metabolicamente attive. In caso di crescita cellulare sostanziale e di una rapida deplezione dei nutrienti del terreno (indicata dall'ingiallimento del terreno), il volume del mezzo di differenziazione intermedio del mesoderma può essere aumentato a 1,3 mL per pozzetto delle piastre a 12 pozzetti.
3. Colture di cellule per altri 14 giorni per ottenere cellule intermedie del mesoderma. Entro il 16° giorno, queste cellule possono essere crioconservate per un uso successivo.

6. Differenziazione delle cellule intermedie del mesoderma derivate da cellule hiPS in podociti (giorni 16-21)

1. Sciacquare le cellule intermedie del mesoderma con DMEM/F12 caldo, quindi incubare le cellule con 0,5 mL per pozzetto di tripsina-EDTA allo 0,05% per 3 minuti a 37 °C. Eseguire l'ispezione visiva per assicurarsi che le cellule inizino a dissociarsi.
2. Raschiare le cellule utilizzando un sollevatore di cellule e pipettare più volte la sospensione cellulare utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 μl per ottenere cellule individualizzate (o piccoli grumi di cellule.
   nota: In questa fase, assicurarsi che le cellule siano completamente dissociate poiché le cellule aggregate potrebbero non riuscire ad acquisire un fenotipo terminalmente differenziato entro la linea temporale del protocollo.
3. Aggiungere circa 2 ml per pozzetto di soluzione neutralizzante della tripsina per fermare l'attività della tripsina.
4. Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 mL e portare il volume fino a 50 mL utilizzando DMEM/F12, quindi centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 201 x g a temperatura ambiente.
5. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule nel mezzo di induzione dei podociti. Per ottenere risultati ottimali, garantire una densità di semina finale di circa 100.000 cellule/pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Aggiungere la sospensione cellulare alle piastre rivestite con matrice BM 2 e agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule in modo più uniforme.
6. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO₂ e rinfrescare il terreno ogni giorno per un massimo di 5 giorni per ottenere podociti entro il giorno 21,
   nota: I podociti derivati da cellule hiPS risultanti possono essere mantenuti in coltura per 2-4 settimane aggiuntive utilizzando un terreno completo con terreni di mantenimento dei podociti. Una volta nei terreni di mantenimento dei podociti, le cellule possono essere alimentate a giorni alterni e possono essere utilizzate per studi successivi o analisi a valle.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
cellule
Cellule iPS umane DU11			La linea cellulare iPS DU11 (clone #11 della Duke University) è stata generata presso la Duke University iPSC Core Facility e ci è stata fornita dal Bursac Lab della Duke University. Questa linea è stata testata per il micoplasma ed è stata cariotipizzata l'ultima volta nel luglio 2019 dal nostro laboratorio ed è risultata cariotipicamente normale.
Fattori di crescita e integratori di terreni
Acido retinoico all-trans (500 mg)	Codice: 72262	Tecnologie delle cellule staminali
Integratore B27 senza siero	17504044	Tecnologie Thermo/Life
CHIR99021	04-0004	Stemgent	Può mostrare variazioni da lotto a lotto
Kit Completo Medio con CultureBoost-R	4Z0-500-R	Sistemi cellulari	Mezzi di manutenzione dei podociti
DMEM/F12	12634028	Tecnologie Thermo/Life
DMEM/F12 con integratore GlutaMAX	10565042	Tecnologie Thermo/Life	DMEM/F12 con integratore di glutammina
FBS inattivato a caldo	10082147	Tecnologie Thermo/Life
Attivina umana A	PHC9564	Tecnologie Thermo/Life
BMP7 umano	PHC9544	Tecnologie Thermo/Life
VEGF umano	PHC9394	Tecnologie Thermo/Life
mTeSR1 medio	Codice 05850	Tecnologie delle cellule staminali	terreni di coltura cellulare hiPS (CCM)
Penicillina-streptomicina, liquida (100×)	Codice: 15140-163	Tecnologie Thermo/Life
Y27632 Inibitore ROCK	Ore 1254	Tocris
anticorpi
Anticorpi secondari coniugati Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 594	A32744; A32754; A-11076; A32790	Tecnologie Thermo/Life
Brachyury(T)	ab20680	Abcam
Nefrin	GP-N2	Progenie
4 OTTOBRE	AF1759	Sistemi di ricerca e sviluppo
PAX2	71-6000	Invitrogen
WT1	MAB4234	Millipore
Molecole ECM
Frammento di iMatrix-511 Laminina-E8 (LM-E8)	N-892012	Iwai Nord America	Matrice della membrana basale (BM) 2
Matrigel matrice qualificata hESC, flaconcino da 5 mL	354277	BD Bioscienze	Matrice della membrana basale (BM) 1. Può mostrare variazioni da lotto a lotto
Enzimi e altri reagenti
Accutase	A1110501	Tecnologie Thermo/Life	Soluzione per il distacco delle cellule
Bsa	Codice: A9418	Sigma-Aldrich
Dimetilsolfossido (DMSO)	D2438	Sigma-Aldrich	Il DMSO è tossico. Deve essere maneggiato in cappa di sicurezza chimica
Tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi, sale bilanciato di Hank	13150016	Tecnologie Thermo/Life
Soluzione di etanolo, 70% (vol/vol), per biotecnologie	Codice 97065-058	VWR	L'etanolo è infiammabile e tossico
FBS	431097	Corning
Paraformaldeide (PFA)	Codice 28906	Tecnologie Thermo/Life	Il PFA deve essere maneggiato in una cappa chimica con adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Evitare l'inalazione e il contatto con la pelle.
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Codice 14190-250	Tecnologie Thermo/Life
Acqua distillata sterile	15230162	Tecnologie Thermo/Life
Triton X-100	97062-208	VWR
Tripsina-EDTA, 0,05%	25300-120	Tecnologie Thermo/Life
attrezzatura
Pipette di aspirazione, confezionate singolarmente	Codice 29442-462	Corning
Centrifuga Avanti J-15R	B99516	Beckman Coulter
Provetta da centrifuga conica, 15 mL	352097	Corning
Provetta da centrifuga conica, 50 mL	352098	Corning
Scatole criogeniche	3395465	Tecnologie Thermo/Life	Per la conservazione di aliquote congelate
EVOS M7000	AMF7000	Tecnologie Thermo/Life	Microscopio fluorescente utilizzato per acquisire immagini di cellule iPS fissate e colorate e dei loro derivati
Emocitometro	Codice 100503-092	VWR
Incubatore a CO2 Heracell VIOS 160i	51030403	Tecnologie Thermo/Life	Per la coltura e il mantenimento di routine di cellule iPS e loro derivati
Zeiss Axio Observer invertito dotato di fotocamera AxioCam 503	491916-0001-000 (microscopio) ; 426558-0000-000 (macchina fotografica)	Microscopia Carl Zeiss	Utilizzato per acquisire immagini a contrasto di fase di cellule iPS vive e dei loro derivati in ogni fase del differenziamento dei podociti
Guanti in nitrile Kimberly-Clark	40101-346	VWR
Kimwipes, grandi	Codice 21905-049	VWR
Kimwipes, piccoli	Codice 21905-026	VWR
Puntali per pipette barriera di precisione P10	P1096-FR	Denville Scientifico
Puntali per pipette barriera P100	P1125	Denville Scientifico
Puntali per pipette barriera P1000	P1126	Denville Scientifico
Puntali per pipette barriera P20	P1121	Denville Scientifico
Puntali per pipette barriera P200	P1122	Denville Scientifico
Pipetta sierologica, 10 mL, confezionata singolarmente	356551	Corning
Pipetta sierologica, 25 mL, confezionata singolarmente	356525	Corning
Pipetta sierologica, 5 mL, confezionata singolarmente	356543	Corning
Steriflip, 0,22 μm, PES	SCGP00525	EMD Millipore
Provette sterili per microcentrifuga	1138W14	Thomas Scientific	Per l'aliquotazione dei fattori di crescita
Piastre a 12 pozzetti trattate con coltura tissutale	353043	Corning
Piastre a 6 pozzetti trattate con coltura tissutale	353046	Corning
Camice da laboratorio VWR techuni bianco	Codice 10141-342	VWR
Sollevatore di celle a smusso largo	3008	Corning