1. Preparazione dei reagenti
- Diluire 5 terreni di coltura cellulare hiPS (CCM) scongelati in terreno basale di coltura cellulare hiPS per ottenere una soluzione 1x di hiPS CCM.
nota: L'integratore congelato 5x hiPS CCM richiede un processo di scongelamento lento, idealmente a 4 °C per la notte. Le aliquote del 1x hiPS CCM possono essere conservate fino a 6 mesi a -20 °C.
- Preparazione di piastre rivestite con matrice 1 a membrana basale (BM) per colture cellulari hiPS: scongelare la matrice BM 1 per una notte su ghiaccio a 4 °C. Una volta scongelate, preparare le aliquote con i fattori di diluizione appropriati come suggerito dal produttore.
nota: Tipicamente, le aliquote vengono preparate per la successiva diluizione in 25 mL di DMEM/F12 freddo in una provetta conica da 50 mL seguita da un'accurata miscelazione per dissolvere completamente la matrice BM 1 ed evitare la formazione di cristalli residui.
- Trasferire 1 mL della soluzione di matrice BM 1 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 1-2 ore o a 4 °C per un minimo di 24 ore, avvolto in una pellicola di paraffina. Le piastre rivestite BM matrix 1 possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparazione delle piastre rivestite con matrice a membrana basale (BM) 2: diluire quantità appropriate di matrice BM 2 in 9 mL di acqua distillata sterile per preparare una concentrazione finale di 5 μg/mL. Aggiungere 700 μl della soluzione di matrice BM 2 a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore o per una notte a 4 °C.
- Preparare 100 μg/mL di soluzioni madre di BMP7, Activina A e VEGF come segue: Ricostituire BMP7 in acqua distillata sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA e ricostituire separatamente l'Activina A e il VEGF in PBS sterile contenente lo 0,1% (wt/vol) di BSA. Per evitare frequenti cicli di gelo-scongelamento, preparare aliquote da 100 μL da ciascuna soluzione madre e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
- Preparare una soluzione madre da 10 mM di Y27632 sciogliendo 10 mg di Y27632 in 3,079 mL di acqua distillata sterile. Aliquotare 100 μL dal magazzino e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
- Sciogliere 2 mg di CHIR99021 in 143,4 μl di DMSO sterile per preparare una soluzione madre da 30 mM. Preparare aliquote da 5 μl e conservare a -20 °C per un massimo di 1 mese (o secondo le raccomandazioni del produttore).
- Sciogliere 10 mg di acido retinoico all-trans in 3,33 mL di DMSO sterile. Preparare aliquote da 500 μl e conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
2. Preparazione dei Terreni Culturali
- Preparare il mezzo di differenziazione del mesoderma ricostituendo le corrispondenti soluzioni madre a una concentrazione finale di 100 ng/mL di activina A, 3 μM di CHIR99021, 10 μM di Y27632 e 1 integratore privo di siero di B27 in un volume appropriato di DMEM/12 con integratore di glutammina.
nota: Il terreno di differenziazione del mesoderma deve essere preparato di fresco prima delle fasi di differenziazione e ad un volume appropriato per la scala dell'esperimento (tipicamente, 50 mL di terreno sono sufficienti per due piastre a 12 pozzetti).
- Preparare il terreno intermedio di differenziazione del mesoderma ricostituendo le corrispondenti soluzioni madre a una concentrazione finale di 100 ng/mL di BMP7, 3 μM di CHIR99021 e 1x integratore privo di siero B27 in DMEM/F12 con un integratore di glutammina.
nota: Se necessario, il terreno può essere integrato con penicillina-streptomicina all'1% (vol/vol). Regolare il volume del terreno utilizzando DMEM/F12 con integratore di glutammina. Questo mezzo può essere preparato in grandi lotti; tuttavia, si consiglia di conservare in aliquote più piccole (ad esempio, 45 mL in provette coniche da 50 mL) per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Questo terreno può essere conservato a -20 °C per un massimo di 3 mesi e può essere scongelato a 4 °C durante la notte prima dell'uso.
- Preparare il terreno di induzione dei podociti ricostituendo a una concentrazione finale 100 ng/mL di BMP7, 100 ng/mL di activina A, 50 ng/mL di VEGF, 3 μM di CHIR99021, 1x integratore privo di siero B27 e 0,1 μM di acido all-trans retinoico in DMEM/F12 con integratore di glutammina. Proteggere il mezzo dalla luce (ad esempio, avvolgendo il contenitore con carta stagnola).
nota: Questo terreno può essere preparato in grandi lotti e conservato al buio a -20 °C per un massimo di 3 mesi. Le aliquote congelate devono essere scongelate per una notte a 4 °C prima dell'uso.
- Preparare 25 mL di soluzione neutralizzante della tripsina aggiungendo il 10% (vol/vol) di FBS inattivato a caldo in DMEM/F12 e filtrare in condizioni sterili.
- Per il mantenimento post-differenziazione dei podociti derivati da cellule staminali, preparare il terreno completo con il terreno di mantenimento dei podociti aggiungendo l'integratore al terreno basale secondo le linee guida del produttore e conservare a 4 °C per un massimo di due settimane.
3. Coltura cellulare hiPS senza alimentatore utilizzando il terreno di coltura cellulare hiPS
- Aspirare la soluzione residua della matrice BM 1 dalle piastre pre-rivestite e lavare i pozzetti 3 volte con 1-2 mL di DMEM/F12 riscaldato.
- Aspirare il CCM hiPS esausto dalle celle hiPS e sciacquare le cellule 3 volte con DMEM/F12 riscaldato. Aggiungere 1 mL di soluzione calda per il distacco delle cellule e incubare per 1 minuto a 37 °C per aiutare a dissociare le cellule. Eseguire l'ispezione visiva delle cellule al microscopio per colture tissutali e assicurarsi che i bordi delle colonie cellulari appaiano arrotondati, quindi aspirare rapidamente la soluzione di distacco cellulare dalle cellule (assicurandosi che le colonie cellulari siano ancora attaccate alla piastra, anche se in modo lasco). Sciacquare delicatamente le cellule una volta con DMEM/F12 per rimuovere la soluzione di distacco delle cellule.
- Aggiungere 3 mL di hiPS CCM alle cellule hiPS (in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) che sono state trattate con la soluzione di distacco cellulare. Raschiare le colonie utilizzando un sollevatore di cellule e pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per rimuovere le cellule che aderiscono liberamente. Lavare accuratamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule vengano raccolte.
nota: Si consiglia l'uso di una pipetta da 5 ml per evitare un taglio eccessivo sulle cellule.
- Trasferire 0,5 mL della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice BM 1 contenente 2 mL di CCM hiPS per pozzetto. Spostare la piastra a forma di otto per distribuire le colonie cellulari all'interno dei pozzetti e incubare a 37 °C in un incubatore al 5 % di CO2. Rinfrescare il terreno ogni giorno fino a quando le cellule sono pronte per essere passate o utilizzate per l'esperimento di differenziazione (circa il 70 % di confluenza).
nota: La dimensione ideale della colonia per il passaggio di routine delle iPSC è compresa tra 200 e 500 μm in condizioni prive di alimentatore utilizzando hiPS CCM (senza inibitore ROCK). Se le cellule vengono individualizzate durante il trattamento con enzimi di dissociazione o tamponi, l'hiPS CCM può essere integrato con un inibitore ROCK (ad es. 10 μM Y27632) per migliorare la vitalità cellulare.
4. Differenziazione delle cellule hiPS in cellule del mesoderma (giorni 0–2)
- Mentre le colture cellulari hiPS sono nella fase di crescita esponenziale (circa entro 4 giorni dalla coltura dopo il passaggio e circa il 70% di confluenza), ispezionare visivamente la presenza di cellule spontaneamente differenziate all'interno e intorno ai bordi delle colonie. Se necessario, raschiare asetticamente le aree di differenziazione.
- Aspirare l'hiPS CCM dalle cellule hiPS e sciacquare le cellule 3 volte con DMEM/F12 caldo. Incubare le cellule con 1 mL di tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi per 10 minuti a 37 °C e verificare la dissociazione al microscopio. A causa delle differenze intrinseche tra le diverse linee cellulari hiPS, il tempo di incubazione effettivo del tampone di dissociazione cellulare deve essere determinato per una data linea cellulare.
- Raschiare delicatamente il pozzetto con un sollevatore di cellule per rimuovere le cellule che aderiscono in modo lasco e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL, quindi pipettare su e giù più volte per individualizzare le cellule hiPS.
- Portare la sospensione cellulare al volume di 15 mL con DMEM/F12 caldo e centrifugare per 5 minuti a 290 x g a temperatura ambiente.
- Aspirare delicatamente il surnatante e risospendere le cellule con DMEM/F12 caldo per un altro ciclo di centrifugazione per rimuovere i componenti residui della matrice BM 1 e del tampone di dissociazione.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di induzione del mesoderma come descritto sopra. Contare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di coltri per determinare il volume appropriato di terreno di differenziazione del mesoderma necessario per raggiungere una concentrazione di 1 x 105 cellule/mL.
- Aspirare la soluzione ECM dalle piastre rivestite con matrice BM 2 e risciacquare le piastre due volte con DMEM/F12 caldo. Miscelare delicatamente la sospensione cellulare hiPS pipettandola alcune volte. Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in ciascun pozzetto delle piastre a 12 pozzetti rivestite con matrice BM a 2 pozzetti, quindi agitare delicatamente le piastre per distribuire le cellule in modo più uniforme.
- Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2. Aggiornare il mezzo di induzione del mesoderma il giorno successivo.
nota: Dopo 2 giorni, le cellule del mesoderma derivate da cellule hiPS sarebbero pronte per l'induzione intermedia del mesoderma.
5. Differenziazione delle cellule del mesoderma derivate da cellule hiPS in mesoderma intermedio (giorni 2-16)
- Il giorno 2 del protocollo di differenziazione, aspirare il terreno di induzione del mesoderma e rabboccare con 1 mL per pozzetto di terreno di induzione intermedio del mesoderma
.
- Aggiornare il terreno ogni giorno per mantenere una soglia accurata di fattori di crescita e piccole molecole per le cellule metabolicamente attive. In caso di crescita cellulare sostanziale e di una rapida deplezione dei nutrienti del terreno (indicata dall'ingiallimento del terreno), il volume del mezzo di differenziazione intermedio del mesoderma può essere aumentato a 1,3 mL per pozzetto delle piastre a 12 pozzetti.
- Colture di cellule per altri 14 giorni per ottenere cellule intermedie del mesoderma. Entro il 16° giorno, queste cellule possono essere crioconservate per un uso successivo.
6. Differenziazione delle cellule intermedie del mesoderma derivate da cellule hiPS in podociti (giorni 16-21)
- Sciacquare le cellule intermedie del mesoderma con DMEM/F12 caldo, quindi incubare le cellule con 0,5 mL per pozzetto di tripsina-EDTA allo 0,05% per 3 minuti a 37 °C. Eseguire l'ispezione visiva per assicurarsi che le cellule inizino a dissociarsi.
- Raschiare le cellule utilizzando un sollevatore di cellule e pipettare più volte la sospensione cellulare utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 μl per ottenere cellule individualizzate (o piccoli grumi di cellule.
nota: In questa fase, assicurarsi che le cellule siano completamente dissociate poiché le cellule aggregate potrebbero non riuscire ad acquisire un fenotipo terminalmente differenziato entro la linea temporale del protocollo.
- Aggiungere circa 2 ml per pozzetto di soluzione neutralizzante della tripsina per fermare l'attività della tripsina.
- Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 mL e portare il volume fino a 50 mL utilizzando DMEM/F12, quindi centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 201 x g a temperatura ambiente.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule nel mezzo di induzione dei podociti. Per ottenere risultati ottimali, garantire una densità di semina finale di circa 100.000 cellule/pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Aggiungere la sospensione cellulare alle piastre rivestite con matrice BM 2 e agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule in modo più uniforme.
- Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 e rinfrescare il terreno ogni giorno per un massimo di 5 giorni per ottenere podociti entro il giorno 21,
nota: I podociti derivati da cellule hiPS risultanti possono essere mantenuti in coltura per 2-4 settimane aggiuntive utilizzando un terreno completo con terreni di mantenimento dei podociti. Una volta nei terreni di mantenimento dei podociti, le cellule possono essere alimentate a giorni alterni e possono essere utilizzate per studi successivi o analisi a valle.
