Articolo metodologico
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30 aprile 2023
Fonte: Burt, M. et al. Differenziazione Guidata di Podociti Renali Maturi da Cellule Staminali Pluripotenti Indotte Umane in Condizioni Chimicamente Definite. J. Vis. Exp. (2020)
In questo video, descriviamo il protocollo per derivare podociti renali umani da cellule staminali pluripotenti indotte attraverso la differenziazione cellulare in condizioni chimiche definite. I podociti generati possono essere utilizzati per i test di nefrotossicità e la modellazione delle malattie.
1. Preparazione dei reagenti
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| cellule | |||
| Cellule iPS umane DU11 | La linea cellulare iPS DU11 (clone #11 della Duke University) è stata generata presso la Duke University iPSC Core Facility e ci è stata fornita dal Bursac Lab della Duke University. Questa linea è stata testata per il micoplasma ed è stata cariotipizzata l'ultima volta nel luglio 2019 dal nostro laboratorio ed è risultata cariotipicamente normale. | ||
| Fattori di crescita e integratori di terreni | |||
| Acido retinoico all-trans (500 mg) | Codice: 72262 | Tecnologie delle cellule staminali | |
| Integratore B27 senza siero | 17504044 | Tecnologie Thermo/Life | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | Può mostrare variazioni da lotto a lotto |
| Kit Completo Medio con CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Sistemi cellulari | Mezzi di manutenzione dei podociti |
| DMEM/F12 | 12634028 | Tecnologie Thermo/Life | |
| DMEM/F12 con integratore GlutaMAX | 10565042 | Tecnologie Thermo/Life | DMEM/F12 con integratore di glutammina |
| FBS inattivato a caldo | 10082147 | Tecnologie Thermo/Life | |
| Attivina umana A | PHC9564 | Tecnologie Thermo/Life | |
| BMP7 umano | PHC9544 | Tecnologie Thermo/Life | |
| VEGF umano | PHC9394 | Tecnologie Thermo/Life | |
| mTeSR1 medio | Codice 05850 | Tecnologie delle cellule staminali | terreni di coltura cellulare hiPS (CCM) |
| Penicillina-streptomicina, liquida (100×) | Codice: 15140-163 | Tecnologie Thermo/Life | |
| Y27632 Inibitore ROCK | Ore 1254 | Tocris | |
| anticorpi | |||
| Anticorpi secondari coniugati Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 594 | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Tecnologie Thermo/Life | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nefrin | GP-N2 | Progenie | |
| 4 OTTOBRE | AF1759 | Sistemi di ricerca e sviluppo | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| Molecole ECM | |||
| Frammento di iMatrix-511 Laminina-E8 (LM-E8) | N-892012 | Iwai Nord America | Matrice della membrana basale (BM) 2 |
| Matrigel matrice qualificata hESC, flaconcino da 5 mL | 354277 | BD Bioscienze | Matrice della membrana basale (BM) 1. Può mostrare variazioni da lotto a lotto |
| Enzimi e altri reagenti | |||
| Accutase | A1110501 | Tecnologie Thermo/Life | Soluzione per il distacco delle cellule |
| Bsa | Codice: A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimetilsolfossido (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | Il DMSO è tossico. Deve essere maneggiato in cappa di sicurezza chimica |
| Tampone di dissociazione cellulare privo di enzimi, sale bilanciato di Hank | 13150016 | Tecnologie Thermo/Life | |
| Soluzione di etanolo, 70% (vol/vol), per biotecnologie | Codice 97065-058 | VWR | L'etanolo è infiammabile e tossico |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldeide (PFA) | Codice 28906 | Tecnologie Thermo/Life | Il PFA deve essere maneggiato in una cappa chimica con adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza. Evitare l'inalazione e il contatto con la pelle. |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Codice 14190-250 | Tecnologie Thermo/Life | |
| Acqua distillata sterile | 15230162 | Tecnologie Thermo/Life | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Tripsina-EDTA, 0,05% | 25300-120 | Tecnologie Thermo/Life | |
| attrezzatura | |||
| Pipette di aspirazione, confezionate singolarmente | Codice 29442-462 | Corning | |
| Centrifuga Avanti J-15R | B99516 | Beckman Coulter | |
| Provetta da centrifuga conica, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Provetta da centrifuga conica, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Scatole criogeniche | 3395465 | Tecnologie Thermo/Life | Per la conservazione di aliquote congelate |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Tecnologie Thermo/Life | Microscopio fluorescente utilizzato per acquisire immagini di cellule iPS fissate e colorate e dei loro derivati |
| Emocitometro | Codice 100503-092 | VWR | |
| Incubatore a CO2 Heracell VIOS 160i | 51030403 | Tecnologie Thermo/Life | Per la coltura e il mantenimento di routine di cellule iPS e loro derivati |
| Zeiss Axio Observer invertito dotato di fotocamera AxioCam 503 | 491916-0001-000 (microscopio) ; 426558-0000-000 (macchina fotografica) | Microscopia Carl Zeiss | Utilizzato per acquisire immagini a contrasto di fase di cellule iPS vive e dei loro derivati in ogni fase del differenziamento dei podociti |
| Guanti in nitrile Kimberly-Clark | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, grandi | Codice 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, piccoli | Codice 21905-026 | VWR | |
| Puntali per pipette barriera di precisione P10 | P1096-FR | Denville Scientifico | |
| Puntali per pipette barriera P100 | P1125 | Denville Scientifico | |
| Puntali per pipette barriera P1000 | P1126 | Denville Scientifico | |
| Puntali per pipette barriera P20 | P1121 | Denville Scientifico | |
| Puntali per pipette barriera P200 | P1122 | Denville Scientifico | |
| Pipetta sierologica, 10 mL, confezionata singolarmente | 356551 | Corning | |
| Pipetta sierologica, 25 mL, confezionata singolarmente | 356525 | Corning | |
| Pipetta sierologica, 5 mL, confezionata singolarmente | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0,22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Provette sterili per microcentrifuga | 1138W14 | Thomas Scientific | Per l'aliquotazione dei fattori di crescita |
| Piastre a 12 pozzetti trattate con coltura tissutale | 353043 | Corning | |
| Piastre a 6 pozzetti trattate con coltura tissutale | 353046 | Corning | |
| Camice da laboratorio VWR techuni bianco | Codice 10141-342 | VWR | |
| Sollevatore di celle a smusso largo | 3008 | Corning |
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