Isolamento delle cellule muscolari lisce del detrusore: una procedura di digestione enzimatica per ottenere cellule DSM da campioni di vescica urinaria umana

Abstract

Fonte: Malysz, J. et al. Preparazione e utilizzo di cellule muscolari lisce detrusoriali umane appena isolate per la caratterizzazione delle correnti cationiche sensibili al 9-fenantrolo. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo l'isolamento delle cellule muscolari lisce del detrusore da campioni di vescica urinaria umana utilizzando un trattamento enzimatico sequenziale in due fasi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Dissezione dei tessuti DSM e preparazione di pezzi DSM privi di mucosa

1. Esaminare il campione di vescica urinaria di intero spessore che è arrivato in laboratorio dalla sala operatoria in un contenitore ermeticamente sigillato riempito con la soluzione fredda di dissezione/digestione (Figura 1 e Tabella 1 per la composizione di DS).
   nota: Il campione viene solitamente conservato in DS freddo da poche ore a tutta la notte prima dell'arrivo in laboratorio. Per una conservazione più lunga, DS (Tabella 1) è integrato con 1 mM di CaCl₂.
2. Rimuovere e risciacquare il campione DSM umano a spessore intero (contenente tutti gli strati compresi mucosa, DSM e sierosa) con DS ghiacciato per lavare via i detriti e il sangue attaccati.
3. Fissare il campione della vescica urinaria, la mucosa rivolta verso l'alto e la sierosa verso il basso, su un piatto rotondo rivestito di silicone (Tabella dei materiali) di 150 mm di diametro riempito con DS ghiacciato (Figura 1B).
4. Rimuovere il tessuto adiposo adiacente, i vasi sanguigni, l'epitelio (urotelio) e la mucosa muscolare dal campione mediante dissezione brusca utilizzando microforbici e pinze.
5. Ritagliare diversi pezzi DSM privi di mucosa (~2–3 mm di lunghezza e 4–6 mm di larghezza) (Figura 1C).

2. Dissociazione enzimatica di pezzi di DSM che producono singole cellule DSM appena isolate

1. Mettere da 3 a 6 pezzi di DSM in una provetta contenente da 1 a 2 mL di DS preriscaldato (~37 °C) contenente papaina e ditiotreitolo (DS-P, Tabella 1) e incubare i pezzi di DSM in DS-P per 30-45 minuti a ~37 °C, agitando delicatamente la provetta di tanto in tanto (una volta ogni 10-15 minuti).
   nota: Per controllare in modo ottimale la temperatura per il trattamento enzimatico, le provette con pezzi di tessuto e soluzioni enzimatiche vengono posizionate in una camera di tessuto di vetro riempita d'acqua collegata a un bagno d'acqua riscaldato circolante (Figura 1D) o in un bagno d'acqua con agitazione a temperatura controllata ad alta precisione (Figura 1E).
2. Rimuovere il DS-P dal tubo, lavare brevemente i pezzi del DSM con il DS ghiacciato, scartare il DS freddo dal tubo lasciando i pezzi del DSM sul fondo del tubo.
3. Aggiungere da 1 a 2 mL di collagenasi di tipo II (DS-C, Tabella 1) alla provetta con i pezzi DSM; mescolare delicatamente e incubare per 25-40 minuti a ~37 °C, agitando delicatamente la provetta di tanto in tanto (ogni 10-15 minuti).
4. Scartare il DS-C e lavare i pezzi DSM trattati con enzimi 5-10 volte con DS ghiacciato.
5. Dopo l'ultimo lavaggio, lasciare la soluzione DS all'interno del tubo; triturare delicatamente con una pipetta Pasteur lucidata a fuoco più volte per rilasciare singole cellule DSM.
6. Posizionare alcune gocce di soluzione DS contenente cellule DSM disperse su una camera con fondo di vetro o su un vetrino coprioggetti e ispezionare visivamente la qualità al microscopio (utilizzando un obiettivo 20x o 40x) dopo almeno 5 minuti dall'applicazione per consentire alle cellule di aderire al fondo.
7. Utilizzare immediatamente le cellule DSM appena isolate per esperimenti elettrofisiologici o conservare le cellule in una provetta contenente DS a ~4 °C su ghiaccio o in frigorifero fino all'uso (in genere per un massimo di 8 ore di preparazione).
   nota: All'interno della stessa preparazione, la qualità delle cellule varia da altamente vitali a cellule DSM morte e iperdigerite (Figura 2). Quando il metodo sequenziale papaina-collagenasi produce un numero molto elevato di cellule non vitali, la preparazione viene scartata e viene effettuata una nuova digestione dei pezzi di DSM, ma con intervalli di incubazione ridotti. Se la procedura risulta in un numero insufficiente di cellule DSM, per la successiva digestione dei pezzi DSM, gli intervalli di incubazione vengono aumentati. L'immunoreattività positiva all'actina muscolare liscia α conferma l'identità delle cellule DSM (Figura 3).

Tipo di soluzione	Composizione (in mM)
DS (Soluzione di dissezione/digestione)	80 Na-glutammato, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 e 11 glucosio, pH aggiustato a 7,4 (con 10 M NaOH)
DS-P (DS contenente papaina)	DS contenente 1-2 mg/ml di papaina, 1 mg/ml di ditiotreitolo e 1 mg/ml di albumina sierica bovina
DS-C (DS contenente collagenasi)	Soluzione di DS contenente 1-2 mg/ml di collagenasi di tipo II, 1 mg/ml di albumina sierica bovina, 0 o 1 mg/ml di inibitore della tripsina e 100-200 μM di Ca2+
P (Pipetta)	110 CsOH, 110 acido aspartico, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA e 30 CsCl, pH aggiustato a 7,2 con CsOH e integrato con amfotericina-B (300-500 μg/ml)
E (Extracellulare)	10 cloruro di tetraetilammonio (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES e 10 glucosio, pH aggiustato a 7,3-7,4 con NaOH o CsOH e 0,002-3 (2-3 mM) nifedipina

Tabella 1: Composizioni di soluzione di dissezione/digestione (DS) e pipette e soluzioni extracellulari utilizzate negli esperimenti di patch-clamp perforati.

Risultati

Figura 1: Riepilogo delle fasi di dissezione che hanno portato alla preparazione dei pezzi di muscolo liscio detrusore (DSM) e alla configurazione utilizzata per la dissociazione enzimatica. Sono mostrate le immagini di: (A) un campione di vescica urinaria umana a spessore intero fornito da un intervento chirurgico alla vescica aperta come materiale chirurgico estran...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubo da 5 ml in polistirene a fondo tondo	Falcone	352054	Provette per DS contenenti enzimi utilizzati nelle fasi della digestione
Miscelatore a vortice analogico	VWR	Codice: 58816-121
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	Codice: A7906	Ds
cloruro di calcio	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C1016	Soluzione extracellulare e DS
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Chelante del Ca2+, utilizzato nella soluzione di pipetta intracellulare
glucosio	sigma	G8270
Collagenasi tipo 2	Società biochimica Worthington	LS004177	DS-C
Idrossido di cesio idrato	Sigma-Aldrich	C8518	Soluzione per pipette intracellulari
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Soluzioni extracellulari e intracellulari
DL-Ditiotreitolo (DDT)	Sigma-Aldrich	D9779	Agenti riducenti usati insieme alla papaina
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
Nifedipina	Sigma-Aldrich	N7634	Bloccante del canale Ca2+ voltaggio-dipendente di tipo L
Rastrelliera/supporto per tubi in schiuma galleggiante	VWR Scientific	82017-634	Utilizzato per contenere tubi con enzimi per il controllo della temperatura
Acido glutammico (sale Na)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
papaina	Società biochimica Worthington	LS003126	DS-P
MgCl2 (esaidrato)	Sigma-Aldrich	Motore M2670	Soluzioni extracellulari e intracellulari
Kcl	Fisher Scientifico	BP366-1	Soluzione extracellulare
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Soluzioni extracellulari e intracellulari
Ago per siringa non metallico, MicroFil	WPI	MF-34G-5	Riempimento della soluzione di pipetta intracellulare
Pipetta Pasteur	FisherBrand	13-678-20A	Le punte vengono rotte e lucidate a fuoco e utilizzate per la titolazione di tessuti trattati enzimaticamente per rilasciare singole cellule DSM dai pezzi
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tampone pH
Thermo Scientific Bagno d'acqua con agitazione di precisione (modello 2870)	Termo Scientifico	Interrotto	Bagno d'acqua per il controllo della temperatura della digestione enzimatica impiegato in alternativa alla configurazione del bagno di circolazione della camera dei tessuti
Tubi in vinile	ColePalmer	Codice 06405-3	Molteplici usi, tra cui il collegamento del bagno di tessuto al bagno di acqua circolante
Circolatore d'acqua, Haake D1 L	Haake	Interrotto	Collegato al bagno di tessuti
Microscopio invertito ZeissAxiovert 40C con obiettivi 10x e 40x	Carl-Zeiss	Interrotto	Parte della configurazione del patch-clamp rig