Analisi del patch-clamp perforato mediato da amfotericina-B: una tecnica elettrofisiologica per studiare le correnti ioniche nelle cellule della vescica urinaria

Abstract

Fonte: Malysz, J. et al. Preparazione e utilizzo di cellule muscolari lisce detrusoriali umane appena isolate per la caratterizzazione delle correnti cationiche sensibili al 9-fenantrolo. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra la caratterizzazione delle correnti cationiche dai canali ionici della melastatina di tipo 4 (TRPM4) con potenziale recettore transitorio nelle cellule muscolari lisce detrusoriali utilizzando la tecnica del patch-clamp perforato mediato da amfotericina-B. La tecnica aiuta a valutare le proprietà biofisiche e farmacologiche dei canali ionici.

Protocol

1. Registrazione delle correnti cationiche indotte da gradini di tensione da celle DSM utilizzando la tecnica di patch-clamp di tensione perforata a celle intere di amfotericina-B

1. Pipettare 0,25-1 mL di sospensione cellulare in una camera con fondo di vetro posizionata su un tavolino di un microscopio invertito e lasciare che le cellule aderiscano al fondo di vetro.
2. Dopo un'incubazione di almeno 45 minuti, rimuovere la soluzione di digestione (DS) dal bagno e sostituirla con la soluzione E (Tabella 1) mediante superfusione, dove il flusso di soluzione assistita dalla gravità attraverso il tubo di ingresso sostituisce lentamente il DS con la nuova soluzione, mentre il tubo di uscita collegato a un recipiente di scarico sottovuoto rimuove la soluzione della camera e impedisce il trabocco><. nota: La soluzione E contiene ioni tetraetilammonio (TEA⁺) e cesio (Cs⁺) per inibire le correnti K⁺.
3. Preparare una soluzione madre di amfotericina-B in dimetilsolfossido (DMSO) (1 mg per 10 μL di DMSO). Per sciogliere completamente la polvere di amfotericina, sonicare (almeno 15 minuti) e agitare bene la soluzione.
   nota: Questo passaggio richiede solitamente meno di 10 minuti. La dissoluzione di 3-4 mg di amfotericina-B in 30-40 μL di DSMO in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL funziona bene. Quantità più elevate di amfotericina-B richiedono più solvente DSMO, con conseguente intervallo più lungo per la miscelazione e la solubilizzazione incompleta delle particelle solide di amfotericina-B presenti nella provetta.
4. Sciogliere la soluzione madre di amfotericina-B nella soluzione della pipetta (soluzione P, Tabella 1) per ottenere una concentrazione finale di 200-500 μg/mL. Questa fase richiede un'ampia sonicazione e vortice ad alta velocità (8-10/10) per ~30-60 minuti per fase per garantire una miscelazione ottimale e prevenire la formazione di precipitato di amfotericina-B nella soluzione della pipetta.
   nota: L'amfotericina-B precipita nel tempo ed è sensibile alla luce. La soluzione di lavoro della pipetta contenente amfotericina-B viene controllata per verificarne la solubilità, miscelata a mano prima del riempimento della pipetta e tenuta al buio.
5. Estrarre più elettrodi patch, lucidare a fuoco le punte degli elettrodi e (se necessario) rivestire le punte con cera dentale.
6. Riempire la punta di un elettrodo patch con la soluzione di pipetta (soluzione P, Tabella 1) senza amfotericina-B immergendo brevemente l'elettrodo nella soluzione.
7. Riempire nuovamente l'elettrodo con la stessa soluzione di pipetta contenente amfotericina-B.
8. Montare l'elettrodo su un supporto collegato a un amplificatore patch-clamp headstage.
9. Utilizzando un micromanipolatore, posizionare l'elettrodo appena sotto la superficie della soluzione extracellulare in modo che la punta dell'elettrodo sia appena sommersa.
10. Nella modalità voltage-clamp, impostare il potenziale di mantenimento su 0 mV e regolare la corrente su 0 pA con la manopola di offset della pipetta sull'amplificatore commerciale (Tabella dei materiali).
11. Determinare la resistenza dell'elettrodo utilizzando la finestra/funzione di test della membrana del software di acquisizione commerciale (Tabella dei materiali). Per attivare l'opzione, fare clic su Strumenti>Test membrana>Play o su un'icona di scelta rapida nel software. La resistenza dell'elettrodo determinata deve essere compresa tra 2 e 5 MΩ.
    nota: La funzione di test della membrana fornita nel software di acquisizione commerciale o l'opzione Seal Test sull'amplificatore possono essere utilizzate per monitorare la resistenza dell'elettrodo applicando ripetutamente i gradini di tensione.
12. Continuare a monitorare la resistenza dell'elettrodo mentre si fa avanzare l'elettrodo verso una cella DSM scelta con un micromanipolatore (Figura 1A).
    nota: Per essere considerata una cellula DSM vitale, la cellula deve mostrare una morfologia allungata a forma di fuso, un alone ben definito attorno alla cellula, bordi nitidi e un aspetto semi-contrattile (serpentino).
13. Quando si tocca la superficie della cella con l'elettrodo, indicato da un rapido aumento della resistenza dell'elettrodo misurata con la funzione di test della membrana, si forma una giga-tenuta applicando una pressione negativa rapida e delicata al portaelettrodo tramite un tubo. Ciò si traduce in una pressione negativa creata sulla punta dell'elettrodo che tira la membrana cellulare nell'elettrodo, favorendo la formazione di una giga-seal o di un contatto molto stretto tra l'elettrodo e la membrana plasmatica (Figura 1B).
14. Una volta formata la giga-seal, compensare la capacità della pipetta regolando i quadranti veloci e lenti sull'amplificatore commerciale e monitorare la stabilità della giga-seal (corrente di dispersione) utilizzando la funzione Membrane Test.
15. Attendere il tempo, in genere 30-60 minuti, affinché l'amfotericina-B si diffonda lungo la pipetta e venga inserita nella membrana plasmatica formando pori principalmente selettivi per i cationi monovalenti. Durante questa fase, continuare a monitorare la giga-seal con la funzione Membrane Test. All'aumentare della perforazione cellulare, aumenta anche l'ampiezza dei transitori di capacità (confrontare la Figura 1B con la Figura 1C che mostra rispettivamente l'assenza e l'efficacia della perforazione cellulare) misurata con la funzione Membrane Test.
16. Quando la perforazione del patch è ottimale (giudicata da una resistenza in serie stabile tipicamente inferiore a 50 MΩ), annullare i transitori di capacità regolando i quadranti per la capacità delle celle e la resistenza in serie sull'amplificatore. In questo momento è possibile eseguire anche la compensazione della resistenza in serie (Figura 1D).
17. Una volta osservate le correnti cationiche stabili indotte dal passo di tensione evocate dal protocollo specificato, applicare un composto o una condizione fisiologica da testare mediante superfusione e registrare le risposte per il controllo, la condizione di test e il washout (se possibile) con il software di acquisizione commerciale.
    1. Registrare le correnti con un protocollo di routine a gradini di tensione che prevede il mantenimento delle celle DSM a -64 o -74 mV e l'aumento della tensione con incrementi di 10 mV per 400 o 500 ms da -94 a +96 o +106 mV e il ritorno al potenziale di mantenimento.
       nota: I valori del potenziale di membrana sono regolati per un potenziale di giunzione del liquido di 14 mV (utilizzando soluzioni P ed E, Tabella 1). Il potenziale di giunzione del liquido si ottiene nel software di acquisizione commerciale (Tabella dei materiali) facendo clic su Strumenti>Potenziali di giunzione e inserendo le concentrazioni dei componenti ionici in soluzione. Un protocollo di rampa può essere utilizzato anche per ottenere le registrazioni correnti.
    2. Eseguire il protocollo di tensione a intervalli continui di ~1 minuto durante un esperimento che registra le correnti per il controllo pre-aggiunta, la condizione di test e il washout

Tipo di soluzione	Composizione (in mM)
DS (soluzione di dissezione/digestione)	80 Na-glutammato, 55 NaCl, 6 KCl, 10 HEPES, 2 MgCl2 e 11 glucosio, pH aggiustato a 7,4 (con 10 M NaOH)
DS-P (DS contenente papaina)	DS contenente 1-2 mg/ml di papaina, 1 mg/ml di ditiotreitolo e 1 mg/ml di albumina sierica bovina
DS-C (DS contenente collagenasi)	Soluzione di DS contenente 1-2 mg/ml di collagenasi di tipo II, 1 mg/ml di albumina sierica bovina, 0 o 1 mg/ml di inibitore della tripsina e 100-200 μM di Ca2+
P (Pipetta)	110 CsOH, 110 acido aspartico, 10 NaCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 0,05 EGTA e 30 CsCl, pH regolato a 7,2 con CsOH e integrato con amfotericina-B (300-500 μg/ml)
E (Extracellulare)	10 cloruro di tetraetilammonio (TEA), 6 CsCl, 124 NaCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES e 10 glucosio, pH aggiustato a 7,3-7,4 con NaOH o CsOH e 0,002-3 (2-3 mM) nifedipina

Tabella 1: Composizioni di soluzione di dissezione/digestione (DS) e pipette e soluzioni extracellulari utilizzate negli esperimenti di patch-clamp perforati.

Results

Figura 1: Illustrazione schematica delle fasi coinvolte nella formazione di giga-seal e nella perforazione dell'amfotericina-B delle cellule DSM umane. Vengono illustrate le posizioni spaziali di una pipetta contenente amfotericina-B e di una cellula DSM insieme alle risposte associate per i test di membrana ottenute nel software di acquisizione commerciale (Tabella dei mater...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo da 5 ml in polistirene a fondo tondo	Falcone	352054	Provette per DS contenenti enzimi utilizzati nelle fasi della digestione
Amfotericina-B	pescatore	BP928-250	Utilizzato per la perforazione di patch/celle
Amfotericina-B	Standard di riferimento della farmacopea europea	5	Utilizzato per la perforazione di patch/celle
Amfotericina-B	Sigma-Aldrich	A9528-100MG	Utilizzato per la perforazione di patch/celle
Miscelatore a vortice analogico	VWR	Codice: 58816-121
acido aspartico	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale A9006	Soluzione per pipette intracellulari
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	Codice: A7906	Ds
CaCl2	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C1016	Soluzione extracellulare e DS
Vetro capillare	Sutter	BF150-110-7.5	Capillare per la preparazione di elettrodi a patch tirati
Idrossido di cesio idrato	Sigma-Aldrich	C8518	Soluzione per pipette intracellulari
Il software Clampex ver. 10 include programmi di acquisizione dati (Clampex) e analisi (Clampfit)	Axon Instruments/ Dispositivi molecolari	pCLAMP-10	Software commerciale e parte della configurazione del patch-clamp rig
CsCl	Sigma-Aldrich	203025	Soluzioni extracellulari e intracellulari
Cera dentale	Tecnologie per cere dentali Miltex, Inc.	18058351
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	solvente
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Chelante del Ca2+, utilizzato nella soluzione di pipetta intracellulare
Estrattore per micropipette fiammante/marrone	Sutter	P-97	Necessario per estrarre elettrodi con punte molto sottili
Rastrelliera/supporto per tubi in schiuma galleggiante	VWR Scientific	82017-634	Utilizzato per contenere tubi con enzimi per il controllo della temperatura
glucosio	sigma	G8270
Acido glutammico (sale Na)	Sigma-Aldrich	G1626	Ds
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tampone pH
Kcl	Fisher Scientifico	BP366-1	Soluzione extracellulare
Sistema di acquisizione dati a basso rumore	Axon Instruments/ Dispositivi molecolari	Digidata 1440A	Parte della configurazione del patch-clamp rig
Agitatore magnetico	VWR	01-442-684
MgCl2 (esaidrato)	Sigma-Aldrich	Motore M2670	Soluzioni extracellulari e intracellulari
MicroForge	Narishige	MF-830	Utilizzato per elettrodi di lucidatura a fuoco
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	Soluzioni extracellulari e intracellulari
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
Nifedipina	Sigma-Aldrich	N7634	Bloccante del canale Ca2+ voltaggio-dipendente di tipo L
Microscopio invertito Nikon, TS100 con tavolino T1-SM con obiettivi 5x, 10x, 20x e 40x	Nikon	Interrotto	Parte della configurazione del rig Patch-clamp
Ago per siringa non metallico, MicroFil	WPI	MF-34G-5	Riempimento della soluzione di pipetta intracellulare
Pipetta Pasteur	FisherBrand	13-678-20A	I puntali vengono rotti e lucidati a fuoco e utilizzati per la titolazione di tessuti trattati enzimaticamente per rilasciare singole cellule DSM dai pezzi
Amplificatore patch-clamp	Axon Instruments/ Dispositivi molecolari	Axon Axopatch 200B	Parte della configurazione del patch-clamp rig
Computer PC	valletta	Configurazione personalizzata	Parte della configurazione del patch-clamp rig
Misuratore di pH	Strumenti Aspera	PH700
Tubi in polietilene	Intramedico	427-436	Tubo per la superfusione del bagno extracellulare collegato alla camera di registrazione con fondo in vetro
Cloruro di tetraetilammonio	Sigma-Aldrich	T2265	Bloccante dei canali ionici dei canali Kv e BK aggiunto alla soluzione del bagno extracellulare
Bilancia di pesatura	Mettler Toledo	XS64
Microscopio invertito ZeissAxiovert 40C con obiettivi 10x e 40x	Carl-Zeiss	Interrotto	Parte della configurazione del patch-clamp rig