Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
NOTA: Topi sani di tipo selvatico (WT) (n = 4) e cd44-/- (n = 4) non trattati sono stati sacrificati all'età di 12-16 settimane. Sono stati utilizzati sia topi maschi che femmine. Tutti i topi erano sullo sfondo C57Bl/6.
1. Dissezione del rene del topo
- Sacrificare topi WT sani o topi geneticamente modificati a causa della lussazione cervicale.
- Seziona i reni interi del topo subito dopo aver sacrificato i topi. Per questo, eseguire una laparotomia mediana usando le forbici addominali, tagliando la pelle e poi i muscoli addominali. Rimuovi l'intestino e posizionalo accanto al topo.
- Libera i reni dal tessuto di collegamento ed estrai il rene usando una pinza chirurgica, tagliando l'arteria renale, la vena renale e l'uretere con le forbici.
- Rimuovere le capsule renali dai reni tenendo il rene con una pinza chirurgica ed estrarre la capsula usando un altro paio di pinze.
- Mettere i reni in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti (2 reni/pozzetto) preparata con 2 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) per pozzetto e metterli su ghiaccio.
2. Isolamento dei glomeruli dal rene di topo
- Trasferire i reni in una capsula di Petri da 100 mm e tritare i reni in piccoli pezzi di 1-2 mm usando due bisturi. Mantenere umidi i pezzi di rene tritati utilizzando 1-2 ml di HBSS.
- Posizionare i pezzi di rene tritati sopra un setaccio di metallo da 300 μm e premere il rene attraverso il setaccio utilizzando uno stantuffo di una siringa da 20 ml. Sciacquare ripetutamente il setaccio con HBSS e raccogliere il flusso in una capsula di Petri pulita utilizzando una pipetta sierologica. Raccogliere anche tutto ciò che rimane/si attacca al lato inferiore del setaccio raschiando via con il bisturi e trasferirlo nel flusso di raccolta (omogeneizzato di reni).
- Sciacquare l'omogeneizzato di rene attraverso un setaccio da 75 μm con HBSS. Raccogliere il flusso di flusso e successivamente risciacquarlo attraverso un setaccio da 53 μm. Lavare entrambi i setacci utilizzando HBSS per rimuovere tutte le strutture più piccole.
nota: In questa fase, il flow-through viene solo risciacquato ma non pressato attraverso il setaccio da 75 μm e 53 μm. Il lavaggio con HBSS è necessario per rimuovere detriti e strutture più piccole sui setacci. Pertanto, normalmente vengono utilizzati in totale 200-300 ml di HBSS.
- Raccogli le strutture/materiale renale che rimangono sul setaccio da 75 μm e 53 μm lavando la superficie superiore dei setacci con il terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 20% di siero fetale di vitello (FCS) e trasferisci il materiale in una micropiastra a 6 pozzetti a bassissimo attacco.
nota: Per lavare la superficie superiore del setaccio, sciacquare il setaccio in posizione inclinata (>45°) e raccogliere il materiale dei reni sul bordo del setaccio. Il materiale raccolto viene arricchito per glomeruli incapsulati e decapsulati, mostrando solo pochi frammenti tubolari. I glomeruli incapsulati sono molto appiccicosi. Per raccogliere singoli glomeruli, è quindi importante evitare che i glomeruli aderiscano alla superficie di una piastra di Petri o di una piastra a pozzetti. Per evitare l'aderenza, utilizzare un terreno con il 20% di FCS e utilizzare piastre di fissaggio ultra-basse per questo passaggio.
3. Coltura della Crescita Glomerulare
- Portare la micropiastra con attacco ultra-basso in un microscopio a ottica invertita e raccogliere singoli glomeruli incapsulati e/o decapsulati con una pipetta da 20 μl. Evitare di pipettare altre strutture e detriti. Dopo aver raccolto un singolo glomerulo nel puntale della pipetta, aggiungere il terreno DMEM fresco senza materiale renale raccolto nello stesso puntale della pipetta fino a un volume di 20 μl.
- Trasferire il singolo glomerulo con il terreno DMEM da 20 μL al centro di un pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti e incubare per 3 ore a 37 °C e 5% (v/v) di CO2 per consentire l'adesione del glomerulo al centro del pozzetto. Spostare con cautela la piastra per evitare che il glomerulo galleggi sui bordi del pozzetto.
- Dopo 3 ore di incubazione, il glomerulo è attaccato al centro del pozzo. Aggiungere con cautela 500 μl di terreno basale endoteliale (EBM) integrato con un kit di fattori di crescita contenente idrocortisone, fattore di crescita endoteliale umano, estratto di cervello bovino e gentamicina solfato-amfotericina B (Tabella dei materiali) e ulteriore 5% (v/v) FBS e 1% (v/v) penicillina/streptomicina (penna/streptococco) a ciascun pozzetto.
- Coltura dei singoli glomeruli per 6 giorni a 37 °C, 5% (v/v) CO2,
NOTA: Entro 6 giorni, si forma l'escrescenza costituita da cellule epiteliali parietali. Se si mira a testare gli effetti di composti o farmaci specifici sulle cellule epiteliali parietali, è necessario aggiungerlo al terreno entro questo periodo di 6 giorni.
