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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Impiantare il tumore
NOTA: Ad ogni topo viene impiantato 1 x 105 cellule MB49-PSA in 50 μL di terreno bianco DMEM nella vescica. A causa dello spazio morto nel catetere, preparare sempre un volume extra (almeno 100 μl in più per topo). Un approccio alternativo sarebbe quello di utilizzare una siringa riempita d'aria.
- cellule
- Un giorno prima dell'impianto, quando le cellule sono confluenti per circa l'80%, far passare le cellule tumorali MB49-PSA in terreni DMEM completi (integrati con il 10% di FBS, 2 mmol/L di L-glutammina, 0,05 mg/mL di penicillina-streptomicina e 200 μg/mL di igromicina B) a 37 °C e il 5% di CO2 con un rapporto di divisione di 1:2.
- Il giorno della procedura, raccogliere le cellule raschiandole delicatamente con un raschietto per cellule sterile. Miscelare volumi uguali della sospensione cellulare e una soluzione di blu di tripano allo 0,4%. Contare le cellule vive utilizzando un emocitometro. Non impiantare se più del 20% delle cellule è morto.
- Calcolare il numero di cellule vive necessarie (2 x 106 cellule/mL) e trasferirle in una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare a 250 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet della cella in un supporto vuoto DMEM. Ripetere il lavaggio tre volte per rimuovere tutte le tracce di FBS prima dell'impianto.
- Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio fino a quando i topi non sono pronti per l'impianto.
- Lasciare che i topi femmina C57BL/6J di 4-6 settimane si acclimatino per una settimana prima della procedura. Tutti i lavori sugli animali devono essere eseguiti in una cabina di sicurezza biologica per mantenere le condizioni di sterilità.
- Pesare ciascun topo e iniettare l'anestesia (75 mg/kg di ketamina e 1 mg/kg di medetomidina) per via intraperitoneale a 0,1 ml per 10 g di peso corporeo. Il peso corporeo dovrebbe essere compreso tra 17 e 22 g. Confermare l'anestesia osservando l'assenza di risposta dopo un pizzicamento del dito del piede.
- Per l'identificazione, segnare l'orecchio con un punzone per le orecchie.
- Iniettare la soluzione di Hartmann o il composto di lattato di sodio per via intraperitoneale a 0,1 ml per 10 g di peso corporeo ogni 1-2 ore per l'idratazione.
- Applicare un unguento oftalmico sterile su entrambi gli occhi utilizzando un bulbo di cotone sterile, poiché il riflesso dell'ammiccamento si perde sotto anestesia e gli occhi si seccano. Riapplicare quando necessario.
- Appoggia i topi in posizione supina su tovaglioli di carta sopra un impacco termico (attivato dal contatto con l'aria) per mantenere la temperatura corporea e fissare le zampe posteriori con del nastro adesivo.
- Con un dito, applicare una leggera pressione sulla regione addominale inferiore e raccogliere l'urina dalla vescica in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Questo campione funge da valore basale del PSA urinario.
- Prelevare la poli-L-lisina sterile (PLL) in una siringa da 1 ml e collegare un catetere IV calibro 24, con lo stiletto dell'ago rimosso. Applicare lubrificante sulla punta del catetere e inserire il catetere attraverso l'uretra nella vescica utilizzando una pinza per guidare il cateterismo. Fermarsi quando si avverte resistenza.
NOTA: I ricercatori dovrebbero discutere con il proprio personale veterinario la necessità dell'uso di un gel lubrificante con anestetico per le instillazioni intravescicali e l'uso di analgesici post-procedura.
- Instillare 50 μL di PLL lentamente, a una velocità di 10 μL ogni 20 s, per evitare il reflusso vescico-ureterale. Lasciare il catetere nella vescica per 20 minuti con un tappo per evitare il deflusso.
- Dopo 20 minuti, rimuovere il catetere e liberare la vescica da qualsiasi contenuto premendo delicatamente sulla regione addominale inferiore. Utilizzando una siringa vuota da 1 ml, eliminare il contenuto rimanente dal catetere.
- Miscelare accuratamente le cellule MB49-PSA mediante pipettaggio ed estrarle in una siringa da 1 ml. Collegare il catetere e applicare il lubrificante. Instillare 50 μl di 1 x 105 cellule a una velocità lenta di 10 μl ogni 20 s. Riposizionare il tappo sul catetere. Somministrare ai topi di controllo 50 μL di soluzione fisiologica.
- Dopo 1 ora, rimuovere i cateteri e liberare la vescica da qualsiasi contenuto. Rimuovi il nastro adesivo sulle zampe posteriori e posiziona i topi sui lati ventrali. Rianimare i topi iniettando per via sottocutanea il farmaco di inversione (1 mg/kg di atipamezolo) a 0,1 ml per 10 g di peso corporeo.
- Monitorare i topi fino a quando non si osserva la motilità. Rimetti i topi nelle loro gabbie.