Somministrazione di plasmidi di DNA nell'urotelio della vescica di topo: una procedura basata sull'elettroporazione per erogare in modo efficiente plasmidi di DNA nelle cellule uroteliali della vescica murina per generare modelli geneticamente modificati

Abstract

Fonte: Chuan, Y. et al. Nuovo metodo di consegna del DNA plasmidico all'urotelio della vescica di topo mediante elettroporazione. J. Vis. Exp.(2018)

Questo video dimostra la somministrazione di plasmidi di DNA nell'urotelio della vescica del topo utilizzando una combinazione di tecniche di cateterismo uretrale ed elettroporazione. La procedura descritta consente la generazione di modelli di cancro della vescica di topo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Plasmide e preparazione degli strumenti

1. Per ogni vescica da trasfettare, preparare almeno 20 μL di plasmide di DNA (1 μg/μL).
2. Aggiungere 1 μL di Blu di Tripano ai 20 μL di soluzione plasmidica in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Pipettare per mescolare bene.
3. Autoclavare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70%. Spruzzare frequentemente strumenti chirurgici e guanti con etanolo al 70% o utilizzare uno sterilizzatore a microsfere di vetro quando si eseguono i seguenti passaggi per mantenere le condizioni sterili.

2. Consegna di plasmidi

1. Applicare etanolo al 70% sull'addome del topo anestetizzato e utilizzare un bisturi per praticare un'incisione verticale di 1 cm per aprire la pelle addominale sopra la vescica.
2. Pipettare almeno 20 μl di soluzione di plasmide più Trypan Blue nell'estremità esterna del catetere e inserire la siringa.
3. Iniettare la soluzione plasmidica nella vescica. Se la vescica diventa blu, l'iniezione ha successo. Lasciare un po' di liquido nel catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.
4. Afferrare l'orifizio uretrale esterno usando una pinzetta, quindi rimuovere il catetere e la siringa. Utilizzare una corda per stringere l'orifizio uretrale esterno. Fai due anelli con lo spago e poi lega con due nodi.
   nota: Il restringimento dell'uretra è importante per prevenire il riflusso del liquido plasmidico.
5. Accendere il generatore di elettroporazione con i seguenti parametri: 33 V, 50 ms di tempo di lavoro e 950 ms di intervallo.
6. Tenere la vescica con una pinzetta e pizzicare la vescica con due elettrodi. Premere il pedale per eseguire l'elettroporazione.
   nota: Gli impulsi elettrici sono impostati per verificarsi 5 volte con brevi intervalli dopo ogni pressione del pedale. Il mouse potrebbe contrarsi durante questo processo. Spingere il pedale più di una volta può aumentare l'efficienza di erogazione, ma troppi impulsi elettrici possono danneggiare l'integrità dei tessuti dell'urotelio.
   1. Evitare qualsiasi contatto tra le pinzette e gli elettrodi, poiché ciò genererà una scintilla.

3. Recupero

1. Sutura l'apertura addominale e cutanea con suture chirurgiche sterili e clip. Applicare lo iodio sulla ferita.
2. Rimuovere l'animale dal sistema isoflurano. Somministrare l'analgesico buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio.
3. Tieni l'animale sul termoforo e rimettilo nella gabbia di casa dopo il completo recupero. Controllare l'animale almeno una volta al giorno per verificare che la mobilità sia normale, che beva e che non ci siano segni di infezione fino a quando l'incisione non è guarita, quindi rimuovere le clip. Somministrare successive iniezioni di analgesico buprenorfina se l'animale mostra sintomi di dolore come riduzione della toelettatura, aumento dell'aggressività e vocalizzazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa BD 1mL TB	pescatore	Codice 148232E
Buprenorfina	sigma	B9275-50MG
Dumont Pinzetta	Roboz Surgical Instr	Missili RS-5005	Trattare con etanolo al 70% prima dell'uso chirurgico
ECM830 SQ Elettroporatore ad onda	Apparato di Harvard	450052
Cateteri endovenosi monouso Safelet Exel International	Fisher Scientifico	Codice 14-841-21	24G, lunghezza 2,11 cm, diametro esterno 0,045 cm
Forbici da micro dissezione extra fini	Roboz Surgical Instr	RS-5135	Trattare con etanolo al 70% prima dell'uso chirurgico
Isoflurano	Veterinario uno	501017
Tappetino riscaldato K&H per piccoli animali, 9 x 12 pollici	amazzone		Copri il tappetino termico con carta assorbente
Unguento oftalmico	pescatore	NC0849514
PBS, pH 7,4	Tecnologie per la vita	10010049
Puntali per pipette 200 μL	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1111-0206
Punte per pipette, montaggio universale; da 0,1 a 10 μl	pescatore	02707438 (CS)
PIPETMAN NEO P2	Gilson	F144561
PIPETMAN NEO P200N	Gilson	F144565
plasmidi CAG-GFP	Addgene	Codice: 16664
Platino pinzetta 5 mm	Apparato di Harvard	450489	Diametro 5 mm
forbici	Roboz Surgical Instr	RS-5880	Trattare con etanolo al 70% prima dell'uso chirurgico
Corda di corda	amazzone		Mandala Artigianato 150D 210D 0.8mm 1mm pelle cucitura cucitura piatto cerato filo corda corda
Nastro, Scotch	pescatore	19047257
Therio-gel Lubrificante Veterinario	PBS salute animale	353-736
Trypan Macchia Blu	Tecnologie per la vita	15250061
V-1 Anestesia del sistema da tavolo	VetEquip	901806
Sutura viola Vicryl 18" FS-2 taglio 5-0	pescatore	NC0578475
Walgreens Iodio Povidone 10%	Walgreens	953982
Clip per ferita	pescatore	Telefono 18045
Applicatore di clip per ferite	pescatore	Anno 1804