Isolamento degli esosomi: una tecnica di ultracentrifugazione basata sulla densità che utilizza un cuscino di saccarosio per separare gli esosomi dai terreni condizionati delle cellule in coltura

Abstract

Fonte: Faruqu, F. N. et al. Preparazione di esosomi per la consegna di siRNA alle cellule tumorali.J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive una tecnica di ultracentrifugazione basata sulla densità per isolare esosomi da terreni condizionati raccolti da colture cellulari di rene embrionale umano utilizzando un cuscino di saccarosio al 25% (p/p) preparato in ossido di deuterio. Gli esosomi isolati possono essere utilizzati per applicazioni a valle.

Protocollo

1. Isolamento dell'esosoma su un cuscino di saccarosio

1. Pre-pulire il mezzo condizionato raccolto (CM) mediante centrifugazione differenziale e filtrazione come segue.
   1. Centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta ed eliminare il pellet. Ripetere ancora una volta questa fase di centrifugazione, recuperando il surnatante e scartando il pellet.
   2. Centrifugare il surnatante dal punto 1.1 a 2.000 x g per 15 minuti e 4 °C, quindi scartare il pellet. Filtrare il surnatante recuperato una volta attraverso filtri da 0,22 μm.
2. Durante la pre-clearing, preparare una soluzione di saccarosio al 25% (p/p) in ossido di deuterio pesando accuratamente 1,9 g (± 0,001 g) di saccarosio in un tubo universale e quindi rabboccando con ossido di deuterio fino a raggiungere il peso di 7,6 g (± 0,001 g).
3. Riempire una provetta per ultracentrifuga (vedere la Tabella dei materiali) con 22,5 mL di CM pre-cleared. Portare il CM a 22,5 mL con PBS filtrato da 0,22 μm se il volume attuale è inferiore.
4. Inserire una pipetta di vetro (vedere Tabella dei materiali) nella provetta e, attraverso di essa, aggiungere 3 mL di soluzione di saccarosio in modo che la soluzione formi uno strato separato sotto il CM.
5. Posizionare con cautela il tubo contenente una soluzione stratificata di CM/saccarosio nel secchio di un rotore estraibile (vedere la Tabella dei materiali) e fissare il secchio nel rotore.
6. Posizionare il rotore nell'ultracentrifuga (vedi Tabella dei materiali) e centrifugare a 100.000 x g per 1,5 ore a 4 °C.
7. Raccogliere 2 mL di strato di saccarosio e aggiungerlo a un flacone per ultracentrifuga (vedere la Tabella dei materiali) contenente 20 mL di PBS filtrato per una fase di lavaggio.
8. Posizionare i tubi in un rotore ad angolo fisso (vedi Tabella dei materiali) e girare a 100.000 x g per 1,5 ore a 4°C.
9. Rimuovere con cautela il surnatante con una pipetta sierologica da 10 ml e risospendere il pellet con 400 μl di PBS filtrato. Mantenere questo stock di esosomi a 4 °C o -80 °C rispettivamente per la conservazione a breve e lungo termine.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
saccarosio	Fisher Scientifico	S/8600/60	1 kg
Ossido di deuterio (D2O)	Sigma-Aldrich	151882	250 g
1X soluzione salina tamponata con fosfato	Thermo Fisher Scientifico	10010015	Flacone da 500 ml
Unità filtro siringa Millex-GP 0,22 μm	Millipore	SLGP033RS
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Optima XPN-80
Rotore oscillante	Beckman Coulter	SW45 Ti
Rotore ad angolo fisso	Beckman Coulter	Tipo 70 Ti
Provette per ultracentrifuga	Beckman Coulter	355631	Policarbonato. Riempimento massimo 32 ml
Flaconi per ultracentrifuga	Beckman Coulter	355618	Policarbonato. Riempimento minimo 16 ml, riempimento massimo 25 ml
centrifuga	Eppendorf	5810R
Pipette in vetro	Fisher Scientifico	Codice 1156-6963
25% p/p cuscino saccarosio			Aggiungere 1,9 g (± 0,001 g) di saccarosio in un tubo universale e rabboccare con D2O fino a raggiungere il peso di 7,6 g (± 0,001 g). Questo fa ~6 ml del cuscino di saccarosio al 25% p/p.