Incapsulamento di siRNA in esosomi mediante elettroporazione: una tecnica basata su impulsi elettrici per caricare siRNA negli esosomi

Abstract

Fonte: Faruqu, F. N. et al. Preparazione di esosomi per la consegna di siRNA alle cellule tumorali. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video descrive un metodo basato sull'elettroporazione per incapsulare siRNA in esosomi. Gli esosomi caricati con siRNA possono quindi essere utilizzati per applicazioni terapeutiche.

Protocollo

1. Incapsulamento di siRNA in esosomi mediante elettroporazione

1. Pre-raffreddare la cuvetta per elettroporazione (vedere la tabella dei materiali) su ghiaccio per 30 minuti prima dell'elettroporazione.
2. Miscelare 7,0 μg di esosomi (32 μL da 7 x 10¹² p/mL stock in PBS) con 0,33 μg di siRNA (12 μL da 2 μM di stock in acqua priva di RNasi) nella provetta per microcentrifuga. Portare il volume a 150 μl con tampone di acido citrico (vedere la tabella dei materiali). In questo caso, il rapporto tra esosoma e molare siRNA è di 1:60.
3. Trasferire il composto in una cuvetta per elettroporazione. Chiudere la cuvetta e posizionarla nel supporto della cuvetta dell'elettroporatore (vedi Tabella dei materiali). Ruotare la rotella girevole di 180° in senso orario.
   nota: La ruota deve essere ruotata completamente in posizione di blocco, in modo che la cuvetta entri in contatto con gli elettrodi.
4. Selezionare il programma di elettroporazione desiderato (ad es. X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, ecc.) e avviare l'elettroporazione premendo il pulsante di avvio.
   nota: Un impulso riuscito viene indicato dalla visualizzazione di "OK" sul display.
5. Una volta elettroporizzata, rimuovere la cuvetta dopo aver ruotato indietro la ruota di 180° in senso antiorario. Estrarre il campione dalla cuvetta con la pipetta di plastica per un'ulteriore elaborazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Atto655-siRNA	Eurogentec	SQ-SIRNA	(etichettato-S) UGC-GCU-ACGAUC-GAC-GAU-G55; (Senza etichetta) CAU-CGU-CGA-UCG-UAGCGC-A55.
Pipette in vetro	Fisher Scientifico	Codice 1156-6963
Nucleofector di Amaxa I	Lonza	Nucleofector I	Con i kit Nucleofector di Amaxa
Tampone acido citrico con EDTA			Mescolare 0,1954 g di acido citrico e 0,2087 g di fosfato disodico in 50 mL di acqua deionizzata. Aggiungere EDTA a 0,1 mM. Regolare il pH a 4,4.
Tubi per microfuge	Laboratorio stellare	S1615-5500	Flacone da 1,5 ml