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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Processamento dei tessuti e isolamento delle cellule tubulari primarie
- Rimuovere le capsule renali e il midollo, tritare entrambi i reni in piccoli pezzi e incubarli in 10 ml di tampone per la digestione in un forno a 37 °C con rotazione delicata per 5 minuti.
- Rimuovere eventuali tessuti renali non digeriti facendo passare il tampone attraverso un filtro da 70 μm. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura per fermare la digestione.
- Per raccogliere le celle tubolari, centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 50 x g per 5 minuti per raccogliere il primo pellet. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e aggiungere 5 mL di terreno di coltura, centrifugarlo a 50 x g per 5 minuti per assicurarsi che tutte le cellule tubulari siano raccolte nel secondo pellet. La centrifugazione è a una velocità inferiore per pellettare principalmente tubuli pesanti. Successivamente, dopo che le cellule si sono riprese dall'isolamento, la coltura tubulare pura viene centrifugata a una velocità maggiore durante le sottocolture.
- Risospendere il primo pellet in 20 mL di terreno di coltura e centrifugarlo a 50 x g per 5 minuti per raccogliere il terzo pellet.
- Risospendere il secondo e il terzo pellet in 1 mL di terreno di coltura. Miscelare 10 μl di sospensione cellulare con 10 μl di Trypan Blue, caricare la miscela nella camera A di un vetrino di conteggio e registrare la vitalità cellulare dal contatore automatico di cellule.
- Semina fino a 10-7 cellule (una popolazione eterogenea) su un singolo piatto da 60 mm pre-rivestito di collagene e lascia che le cellule tubolari si attacchino per una notte.