Colorazione periodica di Schiff acido o PAS: un metodo per valutare le deformità strutturali del glomerulo

1. Colorazione Periodica di Schiff Acido (PAS)

NOTA: La colorazione PAS evidenzierà le membrane basali delle anse capillari glomerulari e l'epitelio tubulare. Consente la visualizzazione dettagliata delle cellule glomerulari, della matrice mesangiale e dell'espansione del potenziale e delle potenziali variazioni del GBM (ad esempio, ispessimento e irregolarità).

1. Sezionare la corteccia renale incorporata in paraffina e fissata con PFA utilizzando un microtomo a 5 μm di spessore su vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Asciugare a 37 °C per 1 ora. Assicurarsi che la sezione non contenga pieghe o fori, che possono distorcere la morfologia al microscopio.
2. Deparaffinare i vetrini incubandoli due volte in xilene (ATTENZIONE, irritante; utilizzare in cappa aspirante) per 3 minuti ciascuno, due volte in EtOH al 100% per 3 minuti ciascuno, e poi una volta in EtOH al 95%, 70% e 50% per 3 minuti ciascuno, il tutto a temperatura ambiente. Reidratare i vetrini in dH₂O.
3. Incubare i vetrini in una soluzione acida periodica (ATTENZIONE, irritante; utilizzare in cappa aspirante) (1 g/dL) per 5 minuti, quindi risciacquare i vetrini in diverse sostituzioni di dH₂O. Utilizzare un contenitore con 100 mL di dH₂O a temperatura ambiente.
4. Incubare i vetrini nel reagente di Schiff (Parasoanilina HCl 6 g/L e metabisolfito di sodio 4% in HCl 0,25 mol/L) per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.
5. Controcolorare con ematossilina per 3 s prima di risciacquare accuratamente i vetrini in acqua corrente del rubinetto per 15 min.
   nota: Potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione per determinare il momento ottimale per la colorazione con ematossilina.
6. Disidratare i vetrini utilizzando l'inverso del protocollo di deparaffinazione. Terminare con lo xilene.
7. Guide ad asciugatura all'aria e montaggio con supporti di montaggio a base di xilene.
8. Immagine su un microscopio ottico con ingrandimento 400X per valutare le strutture glomerulari. Valutare quanto segue: ispessimento e irregolarità del GBM, collasso delle anse capillari, tessuto fibrotico, sclerosi, proliferazione cellulare (cellule endoteliali, podocite e mesangiali, o infiammatorie infiltranti il ciuffo).
   nota: Per una valutazione completa della fisiopatologia glomerulare, devono essere valutate le lesioni in altre parti del rene, come nei tubuli.