Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Esegui l'intervento di iniezione idrodinamica della pelvi renale
- Seleziona attentamente i topi per la chirurgia.
NOTA: Le differenze specifiche del ceppo non sono ancora state osservate, ma potrebbero essere possibili. La maggior parte delle iniezioni sono state effettuate su sfondi C57BL/6 o FVB. Le iniezioni di pelvi renali funzionano meglio nei topi di età compresa tra 6 e 12 settimane. Nei topi con più di 16 settimane, è possibile un tasso di fallimento fino al 50% con l'imaging luciferasi per ragioni poco chiare. Lo stesso tasso di fallimento correlato all'età è stato osservato per le iniezioni idrodinamiche della vena caudale al fegato, quindi questa potrebbe essere una limitazione generale relativa al principio dell'iniezione idrodinamica. Sulla stessa linea, altri hanno dimostrato che l'iniezione idrodinamica della vena caudale nel fegato fibrotico di ratto non è efficace quanto il fegato sano, quindi potrebbe essere possibile che in contesti di fibrosi renale l'iniezione idrodinamica della pelvi renale non sia altrettanto efficace, ma questo non è stato testato direttamente.
2. Prepara Topi e Siringhe di DNA per la chirurgia
- Anestetizzare i topi con ketamina e xilazina.
- Indossare i corretti dispositivi di protezione individuale richiesti dalla struttura per animali, come grembiule da laboratorio usa e getta, maschera chirurgica e guanti in nitrile.
- Lavorando con 2-4 topi contemporaneamente, pesare ciascun topo in un becher di plastica da 500 ml su una bilancia con una precisione di 0,1 g. Calcolare la quantità corretta di 24 mg/mL di ketamina e 2 mg/mL di xilazina diluiti in soluzione fisiologica normale allo 0,9% da somministrare a ciascun topo mediante iniezione intraperitoneale (vedere il video di riferimento per ulteriori informazioni sull'iniezione intraperitoneale). Utilizzare la formula (50 μL + ((5 μL) x [peso(g))), o in alternativa calcolare secondo un'altra formula dopo aver consultato il team veterinario locale e l'IACUC.
- Iniettare il topo mediante iniezione intraperitoneale con tecniche standard. Metti il mouse in un secchio di carta finché il mouse non è immobile.
NOTA: I topi sono pronti per l'intervento chirurgico quando non rispondono più al test di pizzicamento delle dita. Somministrare ai topi che continuano a rispondere al test di pizzicamento delle dita dei piedi 20-30 minuti dopo l'iniezione iniziale 20-60 μl di anestetico in più, a seconda della forza della risposta.
- Posiziona il mouse su un termoforo a circolazione d'acqua coperto da un tampone blu e posiziona un unguento veterinario in entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea.
- Radere il lato sinistro della parte posteriore del mouse dalla spalla alla groppa e dal fianco alla colonna vertebrale con un rasoio progettato per la toelettatura degli animali domestici. Rimuovi i peli sciolti e i detriti.
- Preparare una siringa separata contenente 100 μL di DNA diluito per ogni topo anestetizzato, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria.
- Utilizzare una siringa da insulina sterile 29G x 1/2" 0,5 mL U-100 con un ago collegato in modo permanente senza un sicuro.
NOTA: Il tipo di siringa è di fondamentale importanza. Questo manometro consente un'iniezione rapida. L'ago fissato in modo permanente impedisce la fuoriuscita della soluzione. La presenza di sicurezza impedirà l'accesso alla pelvi renale. Le siringhe specificate nella tabella dei materiali scivolano in modo più uniforme durante l'iniezione rispetto ad altre marche testate.
- Caricare la siringa a ~120 μL e tirare lo stantuffo verso il basso per creare uno spazio nella parte superiore. Picchiettare con una penna fino a quando tutte le bolle d'aria salgono verso l'alto. Tenendo l'ago sollevato, premere con cautela lo stantuffo per rimuovere tutta l'aria fino a formare una gocciolina sulla punta dell'ago. Non dovrebbero essere presenti bolle visibili, in quanto potrebbero causare un'embolia gassosa che ucciderà l'animale.
- Terminare la pressione dello stantuffo fino a quando non ci sono 100 μl nella siringa, svuotando la soluzione di DNA in eccesso nella provetta microfuge originale. Se necessario, etichettare con cura e posizionare le siringhe caricate su un telo sterile per mantenere la sterilità se la struttura in cui viene eseguito il lavoro non consente il riincappucciamento degli aghi.
3. Esegui un intervento chirurgico di iniezione
- Preparare il sito per l'intervento chirurgico. Posizionare un telo sterile sul termoforo e svuotare gli strumenti chirurgici sterili sul telo sterile senza toccarli. Prendi il mouse e posizionalo nel campo visivo. Regola l'illuminazione per illuminare l'area.
- Rimuovere tre tamponi antisettici cutanei con clorexidina gluconato al 3,15% e alcol isopropilico al 70% dalle confezioni e posizionarli vicino all'animale.
- Indossare guanti chirurgici sterili. Lavorando con un movimento circolare a partire dal sito di incisione, tamponare l'animale con un nuovo tampone di clorexidina/alcol tre volte.
- Individuare il sito di incisione come mostrato nella Figura 1A. Pizzicando la pelle con una pinzetta, usa le forbici per fare un taglio sullo strato di pelle a circa 1 cm dalla colonna vertebrale e sotto la gabbia toracica. Una volta che il sito di taglio è lungo circa 1 cm, fare un sito di taglio simile sotto, nello strato muscolare.
NOTA: Praticare l'incisione della giusta lunghezza per consentire al rene di passare a malapena attraverso l'incisione e quindi essere tenuto in posizione dall'incisione stessa. Un'incisione troppo piccola e il rene non può essere esposto; troppo grande e il rene scivolerà continuamente nella cavità addominale.
- Localizza il rene.
nota: Può essere visibile nel tessuto adiposo bianco. Anche la milza si trova sul lato sinistro dell'animale. Il colore di questi organi può essere differenziato visivamente, poiché la milza è di un marrone scuro mentre il rene è di un rosso-arancio scuro. Non è desiderabile manipolare la milza in quanto può essere facilmente rotta.
- Senza toccare il rene, esponilo delicatamente dalla cavità addominale esercitando una pressione costante e delicata sull'addome con le dita (Figura 2C). Usa una pinzetta chiusa per spingere delicatamente gli organi indesiderati nell'addome, se necessario. Non utilizzare pinze aperte in quanto ciò potrebbe danneggiare i reni o altri organi.
- Una volta che il rene è fuori dall'addome, separalo delicatamente dal grasso circostante quel tanto che basta per visualizzare la pelvi renale, un piccolo punto bianco (Figura 1B). Spingere da parte il grasso in eccesso o rimuoverlo se necessario. Assicurati di non rimuovere la ghiandola surrenale, situata vicino al polo superiore del rene, o la capsula renale.
- Usando una pinza chiusa per spingere verso il basso il lato destro del rene in modo che la pelvi renale rimanga in vista, afferrare la siringa da insulina carica con la mano destra e tenerla parallela alla superficie di lavoro con l'ago puntato verso la pelvi renale (Figura 2E). Inserire con cautela l'ago nella pelvi renale del rene immobilizzato come mostrato nella Figura 1B.
- Iniettare rapidamente la soluzione entro tre secondi. Circa un terzo del rene può schiarirsi e cambiare colore in bianco.
NOTA: È comune osservare l'accumulo di liquidi nella capsula renale dopo l'iniezione e la formazione di un ematoma. È necessario un certo danno per raggiungere un livello sufficiente di trasfezione del DNA per il rilevamento.
- Tenere l'ago in posizione per circa 10 secondi per evitare il riflusso della soluzione. Quindi rimuovere con cautela e lentamente l'ago. Riportare l'organo nella cavità addominale allungando delicatamente il sito di incisione e utilizzando una pinza chiusa.
- Sutura lo strato muscolare dell'animale con suture 5-0 riassorbibili, posizionando 2-4 nodi indipendenti.
- Sutura lo strato cutaneo dell'animale con suture di nylon non assorbibili 5-0 o 6-0, posizionando 2-4 nodi indipendenti.
NOTA: Gli strumenti chirurgici possono essere riutilizzati dopo essere stati messi in un bagno di perline sterile e raffreddati.
