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1. Impianto di cellule
Per impiantare le cellule Renca per via intrarenale, preparare le cellule Renca in una sospensione a singola cellula a 2 x 106 cellule/mL nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
- Rimuovere le cellule Renca aderenti dal pallone di coltura tissutale utilizzando tripsina allo 0,25% in HBSS. Dopo ~5 minuti, aggiungere un RPMI completo al pallone per neutralizzare la tripsina e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga per il lavaggio. Centrifugare le celle a 300 g di forza centrifuga relativa (rcf x g) per 5 minuti a 25 °C.
- Decantare il surnatante e risospendere le cellule in HBSS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare il volume con HBSS per ottenere 2 x 106 cellule/mL.
- Aspirare le cellule in una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 18 per evitare lo stress da taglio sulle cellule. Sostituire l'ago calibro 18 con un ago calibro 28 prima dell'iniezione delle cellule tumorali. Un'iniezione di 0,1 mL eroga 2 x 105 cellule nel rene.
2. Preparazione dell'area chirurgica
- Preparare un'area chirurgica sterile in una cabina di biosicurezza posizionando un telo chirurgico sterile su un termoforo. Raccogli tutte le provviste, tra cui pinze, bisturi, forbici, collirio, antisettico allo iodio povidone al 5% e garze sterili. Autoclavare tutti gli strumenti prima dell'uso.
- Eseguire l'intervento chirurgico utilizzando una tecnica di punta asettica. Risterilizzare gli strumenti tra gli animali con uno sterilizzatore a microsfere. Indossa guanti sterili, un camice da laboratorio e una maschera facciale.
3. Preparazione degli animali
- Anestetizzare i topi con ketamina/xilazina (87,5 mg/kg e 12,5 mg/kg, rispettivamente, i.p.) secondo le linee guida istituzionali. Determinare la profondità dell'anestetico eseguendo un pizzicamento delle dita.
- Quando l'animale è considerato non responsivo, preparare il sito di iniezione (ad esempio, il fianco sinistro) sui topi Balb/c spennando (con le dita) o radendo (usando un tagliacapelli) il pelo.
- Sposta i topi dall'area di preparazione dell'intervento chirurgico (ad esempio, la gabbia di alloggiamento) all'area chirurgica e applica un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Tamponare generosamente il sito di incisione preparato con antisettico allo iodio povidone al 5%.
- Iniettare bupivacaina cloridrato (0,1 mL di una soluzione da 2,5 mg/mL, s.c.) nell'area in cui verrà praticata l'incisione come analgesia preoperatoria.
- Praticare una singola incisione (~1,0-1,5 cm) sul fianco sinistro dell'animale utilizzando con cura un bisturi sterile o delle forbici per non penetrare nel peritoneo. Separare il derma dal peritoneo con forbici sterili. Tamponare il sito dell'incisione con una garza di cotone sterile per rimuovere il sangue.
- Tieni il mouse con entrambe le mani, usando la mano sinistra per tenere la testa e la mano destra per sostenere il fianco.
- Identificare la milza attraverso il peritoneo e, con un dito della mano destra, palpare il topo da sotto; il rene dovrebbe ora essere visibile attraverso il peritoneo. Mantieni una presa salda sull'animale per fornire tensione attraverso il peritoneo e il rene.
- Chiedere a un'altra persona di iniettare le cellule tumorali (preparate nel paragrafo 1.2) attraverso il peritoneo intatto al centro del rene utilizzando una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 28. Erogare lentamente 0,1 mL (2 x 105) di cellule. Una volta iniettate le cellule, tenere l'ago in posizione per 5-10 secondi per ridurre il riflusso delle cellule. È importante notare la necessità di estrema cautela durante questo passaggio, poiché la persona che inietta le cellule porterà l'ago in prossimità delle dita della persona che tiene il mouse.
- Rimuovere l'ago e chiudere l'incisione con un sottile strato di adesivo tissutale cianoacrilato.
- Rimetti l'animale in una gabbia pulita con un tovagliolo di carta sterile. Lascia che gli animali si riprendano su un termoforo. Non lasciare gli animali incustoditi durante il periodo di recupero. Non riportare gli animali nelle condizioni di stabulazione standard fino a quando non sono in posizione eretta e sternale. Seguire le linee guida istituzionali in tutte le procedure che utilizzano animali da laboratorio.