Analisi dell'espressione proteica basata su array di proteine a fase inversa: una procedura per la quantificazione simultanea dell'espressione di più proteine dal lisato cellulare

Abstract

Fonte: O'Mahony, F. C. et al. L'uso di array di proteine a fase inversa (RPPA) per esplorare la variazione dell'espressione proteica all'interno di singoli tumori a cellule renali. (2013)

Questo video dimostra la metodologia per l'esecuzione di Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) per studiare i modelli di espressione proteica dal lisato cellulare. Nell'RPPA, il lisato contenente una miscela di proteine viene stampato su vetrini di nitrocellulosa e le proteine di interesse vengono analizzate utilizzando anticorpi marcati in fluorescenza.

Protocol

1. Stampa RPPA

1. I lisati proteici sono stati individuati su vetrini rivestiti di nitrocellulosa (Fastslides-Whatman) utilizzando uno spotter robotico MicroGrid II. I vetrini utilizzati contenevano 2 tamponi su cui sono stati individuati i campioni. Ogni pad è stato individuato con campioni identici, in questo caso 100 campioni. Altri formati disponibili includono 1, 8 e 16 diapositive per pad. Maggiore è il numero di tamponi, minore è il numero di campioni che possono essere individuati su ciascuno.
2. Da ciascun campione è stata effettuata una serie di cinque diluizioni di 2 volte e ciascuna è stata poi individuata in triplicato (per un totale di 15 punti per campione).

2. Rilevamento delle proteine RPPA

1. Vetrini bagnati in eccesso di LiCor Blocking Buffer (diluito 50:50 in PBS). Incubare a RT per 1 ora su una piattaforma a dondolo.
2. Preparare 800 μl di anticorpi primari nel tampone bloccante LiCor (diluito 50:50 in PBS) alle concentrazioni desiderate e conservare in ghiaccio.
3. Montare i vetrini in (i) la Chip Clip a telaio singolo o (ii) il supporto per vetrini a quattro alloggiamenti "FastFrame" in modo da formare una tenuta ermetica tra il vetrino e la camera di incubazione.
4. Rimuovere il tampone residuo dai pozzetti e aggiungere 600 μL di anticorpo primario ai rispettivi pozzetti.
5. Collocare il vetrino e la camera in una scatola umida sigillata e incubare su una piattaforma oscillante per una notte a 4 °C.
6. Preparare lo 0,1% di PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 mL di PBS).
7. Rimuovere i vetrini dalla cella frigorifera e rimuovere con cura gli anticorpi primari da ciascun pozzetto.
8. Aggiungere 600 μl di PBS-T e lavare i vetrini sulla piattaforma oscillante a RT per 5 minuti (X3).
9. Preparare gli anticorpi secondari marcati in fluorescenza diluendo in Odyssey Blocking Buffer (diluito 50:50 in PBS) 0,01% SDS a diluizione 1:2.000 (1 μL/2 mL) in prima istanza.
10. Rimuovere il tampone dai pozzetti e aggiungere 600 μL di anticorpi secondari marcati in fluorescenza ai rispettivi pozzetti. Incubare gli anticorpi secondari a temperatura ambiente per 45 minuti agitando delicatamente; È importante proteggere la membrana dalla luce fino al momento in cui è stata finalmente scansionata.
11. Rimuovere gli anticorpi secondari dal pozzetto e lavare brevemente (x3) in 600 μl di PBS-T a temperatura ambiente. Rimuovere il vetrino dal supporto, trasferirlo in un contenitore adatto e lavare in eccesso il PBS-T per 15 minuti, mantenendo la membrana al buio.
12. Rimuovere il PBS-T e lavare ulteriormente la membrana con PBS a temperatura ambiente per 15 minuti per rimuovere il Tween-20 residuo, mantenendo nuovamente la membrana al buio.
13. Asciugare il Fastslide in forno a 50 °C per 10 minuti e poi eseguire la scansione con lo scanner Li-Cor Odyssey. Tenere il vetrino al buio fino a quando non è stato scansionato.
14. Scansionare il vetrino a 680 nm e/o 800 nm a seconda dell'anticorpo o degli anticorpi secondari utilizzati. Per il rilevamento a due colori, utilizzare sempre anticorpi secondari altamente adsorbiti per ridurre al minimo la reattività crociata. Per la rilevazione a due colori è necessaria un'attenta selezione degli anticorpi primari e secondari. Di primaria importanza è la selezione di diverse specie ospiti (ad esempio coniglio e topo) per i due anticorpi primari. Ciò consente la discriminazione da parte di anticorpi secondari anti-coniglio e anti-topo che sono marcati con colorante con spettri di emissione facilmente distinguibili.
15. I file di immagine vengono salvati come file .tiff. La Figura 1 illustra l'immagine dei file acquisiti.

Results

Figura 1. Diagramma di flusso del processo di scansione RPPA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Triton X-100	Triton-X	T8787
Tampone di blocco Li-Cor Odyssey	Li-Cor	927-40000
Osservatore robotico MicroGrid II	Biorobotica
Supporto per guide a quattro alloggiamenti FastFrame	Whatman	10486001
FAST Slide - 2 cuscinetti	Whatman	10485317
IRDye 680LT Capra anti-Topo IgG	Licor	Codice 926-68020
IRDye 800CW Capra anti-Coniglio IgG	Licor	Codice 926-32211