Analisi dell'espressione proteica basata su array di proteine a fase inversa: una procedura per la quantificazione simultanea dell'espressione di più proteine dal lisato cellulare

Abstract

Fonte: O'Mahony, F. C. et al. L'uso di array di proteine a fase inversa (RPPA) per esplorare la variazione dell'espressione proteica all'interno di singoli tumori a cellule renali. (2013)

Questo video dimostra la metodologia per l'esecuzione di Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) per studiare i modelli di espressione proteica dal lisato cellulare. Nell'RPPA, il lisato contenente una miscela di proteine viene stampato su vetrini di nitrocellulosa e le proteine di interesse vengono analizzate utilizzando anticorpi marcati in fluorescenza.

Protocollo

1. Stampa RPPA

1. I lisati proteici sono stati individuati su vetrini rivestiti di nitrocellulosa (Fastslides-Whatman) utilizzando uno spotter robotico MicroGrid II. I vetrini utilizzati contenevano 2 tamponi su cui sono stati individuati i campioni. Ogni pad è stato individuato con campioni identici, in questo caso 100 campioni. Altri formati disponibili includono 1, 8 e 16 diapositive per pad. Maggiore è il numero di tamponi, minore è il numero di campioni che possono essere individuati su ciascuno.
2. Da ciascun campione è stata effettuata una serie di cinque diluizioni di 2 volte e ciascuna è stata poi individuata in triplicato (per un totale di 15 punti per campione).

2. Rilevamento delle proteine RPPA

1. Vetrini bagnati in eccesso di LiCor Blocking Buffer (diluito 50:50 in PBS). Incubare a RT per 1 ora su una piattaforma a dondolo.
2. Preparare 800 μl di anticorpi primari nel tampone bloccante LiCor (diluito 50:50 in PBS) alle concentrazioni desiderate e conservare in ghiaccio.
3. Montare i vetrini in (i) la Chip Clip a telaio singolo o (ii) il supporto per vetrini a quattro alloggiamenti "FastFrame" in modo da formare una tenuta ermetica tra il vetrino e la camera di incubazione.
4. Rimuovere il tampone residuo dai pozzetti e aggiungere 600 μL di anticorpo primario ai rispettivi pozzetti.
5. Collocare il vetrino e la camera in una scatola umida sigillata e incubare su una piattaforma oscillante per una notte a 4 °C.
6. Preparare lo 0,1% di PBS-Tween20 (PBS-T; 100 μL Tween 20/100 mL di PBS).
7. Rimuovere i vetrini dalla cella frigorifera e rimuovere con cura gli anticorpi primari da ciascun pozzetto.
8. Aggiungere 600 μl di PBS-T e lavare i vetrini sulla piattaforma oscillante a RT per 5 minuti (X3).
9. Preparare gli anticorpi secondari marcati in fluorescenza diluendo in Odyssey Blocking Buffer (diluito 50:50 in PBS) 0,01% SDS a diluizione 1:2.000 (1 μL/2 mL) in prima istanza.
10. Rimuovere il tampone dai pozzetti e aggiungere 600 μL di anticorpi secondari marcati in fluorescenza ai rispettivi pozzetti. Incubare gli anticorpi secondari a temperatura ambiente per 45 minuti agitando delicatamente; È importante proteggere la membrana dalla luce fino al momento in cui è stata finalmente scansionata.
11. Rimuovere gli anticorpi secondari dal pozzetto e lavare brevemente (x3) in 600 μl di PBS-T a temperatura ambiente. Rimuovere il vetrino dal supporto, trasferirlo in un contenitore adatto e lavare in eccesso il PBS-T per 15 minuti, mantenendo la membrana al buio.
12. Rimuovere il PBS-T e lavare ulteriormente la membrana con PBS a temperatura ambiente per 15 minuti per rimuovere il Tween-20 residuo, mantenendo nuovamente la membrana al buio.
13. Asciugare il Fastslide in forno a 50 °C per 10 minuti e poi eseguire la scansione con lo scanner Li-Cor Odyssey. Tenere il vetrino al buio fino a quando non è stato scansionato.
14. Scansionare il vetrino a 680 nm e/o 800 nm a seconda dell'anticorpo o degli anticorpi secondari utilizzati. Per il rilevamento a due colori, utilizzare sempre anticorpi secondari altamente adsorbiti per ridurre al minimo la reattività crociata. Per la rilevazione a due colori è necessaria un'attenta selezione degli anticorpi primari e secondari. Di primaria importanza è la selezione di diverse specie ospiti (ad esempio coniglio e topo) per i due anticorpi primari. Ciò consente la discriminazione da parte di anticorpi secondari anti-coniglio e anti-topo che sono marcati con colorante con spettri di emissione facilmente distinguibili.
15. I file di immagine vengono salvati come file .tiff. La Figura 1 illustra l'immagine dei file acquisiti.

Risultati

Figura 1. Diagramma di flusso del processo di scansione RPPA.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Triton X-100	Triton-X	T8787
Tampone di blocco Li-Cor Odyssey	Li-Cor	927-40000
Osservatore robotico MicroGrid II	Biorobotica
Supporto per guide a quattro alloggiamenti FastFrame	Whatman	10486001
FAST Slide - 2 cuscinetti	Whatman	10485317
IRDye 680LT Capra anti-Topo IgG	Licor	Codice 926-68020
IRDye 800CW Capra anti-Coniglio IgG	Licor	Codice 926-32211