Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione delle Soluzioni
- Preparare una soluzione madre 50x di terreno embrionale E3 mescolando 73,0 g di NaCl, 3,15 g di KCl, 9,15 g di CaCl2 e 9,95 g di MgSO4 in 5 L di acqua distillata e conservare in RT.
- Preparare una soluzione madre 50x di terreno embrionale E3 mescolando 73,0 g di NaCl, 3,15 g di KCl, 9,15 g di CaCl2 e 9,95 g di MgSO4 in 5 L di acqua distillata e conservare in RT.
- Per la coltura di embrioni di zebrafish, diluire la soluzione madre 50x di terreno embrionale E3 in una soluzione di lavoro 1x con acqua distillata, quindi aggiungere 200 μl di blu di metilene allo 0,05% a ogni 1 L di E3 1x per agire come fungicida e conservare in RT.
- Preparare una soluzione che blocca la pigmentazione del terreno embrionale E3 con 1-fenil-2-tiourea (PTU) allo 0,003% combinando 40 ml del ceppo E3 50x con 0,06 mg di PTU. Quindi portare il volume a un totale di 2 L con acqua distillata.
- Mescolare l'E3/PTU O/N a RT per ottenere la polvere di PTU in soluzione. Quindi, conservare l'E3/PTU su RT.
nota: L'E3/PTU ha una durata di circa una settimana e le soluzioni più vecchie saranno meno efficaci nel bloccare lo sviluppo della pigmentazione nelle larve di zebrafish.
- Preparare una soluzione anestetica di tricaina allo 0,2% (MS-222) aggiungendo 1 g di tricaina a 500 ml di acqua distillata e regolare il pH a 7,2 con 1 M di Tris, pH 9,5.
2. Preparazione degli strumenti
- Preparare uno strumento manipolatore di embrioni, utilizzato per posizionare gli embrioni per la microiniezione, attaccando una punta di caricamento del gel all'estremità di un ago da dissezione dritto da 5 pollici e fissarlo con nastro adesivo o supercolla.
- Preparare gli aghi per microiniezione utilizzando un estrattore per aghi, inserendo prima un vetro borosilicato da 10 cm lucidato a fuoco con filamento nello strumento e fissare il vetro borosilicato serrando le impugnature.
- Tirare il vetro borosilicato per modellare aghi affusolati. Utilizzare le seguenti impostazioni: calore 540, trazione 245, velocità 200 e tempo 125.
- Posizionare gli aghi all'interno di una capsula di Petri, sospendendoli su una striscia di argilla da modellare per proteggere le punte degli aghi, e tenere la piastra coperta per evitare l'accumulo di polvere.
- Per completare la preparazione dell'ago per le microiniezioni, utilizzare una lama di rasoio o un bordo a pinza fine per tagliare l'estremità tirata dell'ago in modo da creare una punta di iniezione angolare affilata con un diametro di circa 0,05-0,1 mm.
- Per preparare il vassoio per microiniezione, preparare una soluzione di agarosio/E3 all'1,5% in un pallone di Erlenmeyer da 100 ml e sciogliere l'agarosio riscaldando l'E3 a ebollizione in un forno a microonde, quindi lasciare raffreddare a RT per circa 10 minuti.
- Versare la soluzione raffreddata di agarosio/E3 in una capsula di Petri per ottenere una base con una profondità di circa 0,5 cm. Quando questo si è solidificato, versare un secondo strato con una profondità di circa 0,3 cm e inserire lo stampo prefabbricato per l'embrione e lasciare solidificare l'agarosio a RT.
nota: Quando si inserisce lo stampo nello strato superiore di agar/E3, posizionare lo stampo nell'agar ad angolo per ridurre il numero di bolle d'aria.
- Quando l'intero vassoio per microiniezione si è solidificato, sollevare il pozzetto dell'embrione prefabbricato, modellare lentamente e con attenzione utilizzando una scoopula, quindi riempire il piatto con la soluzione E3 e conservare a 4 °C.
3. Microiniezione di soluzione di nefrotossine
- Il giorno dell'iniezione, preparare la soluzione di nefrotossine desiderata insieme al controllo del veicolo appropriato.
- Agitare o mescolare delicatamente per assicurarsi che il farmaco o i farmaci siano in soluzione, controllando i lati del tubo e la parte superiore della colonna d'acqua><.
nota: Le soluzioni di nefrotossine possono essere preparate per contenere tracce di destrano coniugato fluorescente per monitorare l'efficienza della microiniezione e anche valutare la clearance renale in punti temporali successivi.
- Caricare un ago per microiniezione tagliato con ~2-3 μL di nefrorotossina infilando una punta di caricamento in gel sottile nella parte posteriore dell'ago e sospendere l'ago verticalmente con un pezzo di nastro adesivo per consentire alla soluzione di riempire la punta dell'ago tagliata per gravità.
- Una volta che la punta dell'ago è piena, fissare l'ago carico nel micromanipolatore.
- Testare il volume di microiniezione posizionando una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e iniettare nell'olio per valutare la dimensione delle goccioline. Un volume di iniezione di 500 pl ha un diametro di 0,1 mm.
- Rimuovere la capsula degli embrioni dall'incubatrice e anestetizzare aggiungendo circa 5 ml di tricaina allo 0,2% alla capsula dell'embrione.
- Per garantire un'anestesia completa, toccare delicatamente l'embrione con la punta dello strumento manipolatore di embrioni. La mancanza di movimento indica un'anestesia sufficiente.
- Dopo l'anestesia riuscita, trasferire gli embrioni nello stampo a iniezione con una pipetta di trasferimento.
- Manovrare ogni embrione in un pozzetto diverso dello stampo, posizionando la testa nella zona più profonda del pozzo in modo tale che il tronco poggi lungo la depressione e la coda sporga dalla depressione.
- Inserire l'ago riempito nel micromanipolatore e posizionare la punta dell'ago accanto a un embrione.
- Inserire delicatamente l'ago nel vaso di coda spostando il joystick in avanti e premere il pedale per erogare la microiniezione.
nota: Il successo dell'iniezione può essere misurato osservando il liquido entrare in circolo. Inoltre, la co-iniezione del nefrotossico con destrano coniugato fluorescente consente al ricercatore di verificare il successo dell'iniezione dopo la procedura.
- Tira delicatamente indietro il joystick per rimuovere l'ago dall'embrione.
- Dopo l'iniezione, trasferire gli embrioni in un piatto pulito e risciacquare per rimuovere la tricaina e sostituirli con E3/PTU fresco.
- Incubare l'embrione fino al momento desiderato per valutare la morfologia, che può essere documentata mediante fotografia in mezzi di montaggio in metilcellulosa, o processo per l'analisi sperimentale come desiderato.
nota: Il recupero degli embrioni deve essere valutato per determinare la percentuale di individui con edema, che comunemente indica un danno renale.
