Preparazione del rene a montaggio piatto: una procedura per sezionare e preparare un supporto piatto per l'analisi microscopica del rene adulto del pesce zebra

Abstract

Fonte: McCampbell, K. K. et al. Analisi della composizione e della funzione del nefrone nel rene adulto del pesce zebra.J. Vis. Exp. (2014)

Questo video mostra la dissezione e la preparazione di una montatura piatta del rene adulto del pesce zebra. La montatura piatta preparata può essere visualizzata al microscopio per l'analisi dei campioni.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Dissezione e preparazione a montaggio piatto del rene adulto di pesce zebra da un campione animale non fissato per visualizzare l'etichettatura fluorescente del destrano del tubulo prossimale

1. Sopprimere il pesce zebra adulto iniettato con destrano mettendolo in un piatto con tricaina allo 0,2% pH 7,0 per 4-5 min.
   nota: Assicurarsi che il pesce sia stato soppresso prima di procedere, monitorando attentamente se le branchie hanno smesso di muoversi e il cuore ha smesso di battere.
2. Usando un cucchiaio di plastica, solleva il pesce dalla soluzione di tricaina, travasa la soluzione e posiziona l'animale su un fazzoletto o un tovagliolo di carta.
3. Usa un paio di forbici da dissezione affilate per fare un taglio dietro l'opercolo branchiale e rimuovere la testa.
4. Aprire immediatamente il corpo del pesce con le forbici da dissezione praticando una lunga incisione ventrale dalla testa alla base della pinna caudale.
5. Rimuovere gli organi interni del pesce usando un paio di pinze sottili.
6. Utilizzare aghi da dissezione super sottili per aprire le pareti del corpo per consentire la visualizzazione dell'organo renale, che è aderente alla parete dorsale dell'animale.
7. Usa una pinza sottile per staccare il rene dalla parete dorsale.
8. Posizionare delicatamente il rene in una fiala di vetro da 5 ml contenente 1X PBS e lavare 3 volte con 3-5 ml di 1X PBS fresco per 5 minuti ciascuno.
   nota: L'uso di una fiala di vetro per la manipolazione di campioni di rene adulto facilita la visualizzazione del tessuto e consente lavaggi con grandi volumi (rispetto alla massa tissutale) di circa 3-5 mL. In alternativa, è possibile utilizzare una piastra per colture cellulari a 12 pozzetti. Mentre si potrebbe utilizzare una provetta da microcentrifuga in plastica, le provette di dimensioni standard (1,5 mL) potrebbero limitare il lavaggio.
9. Rimuovere il rene con una pipetta di trasferimento e posizionarlo su un vetrino pulito con 1-2 gocce di 1X PBS.
10. Utilizzare una pinza fine, appiattire il rene sul vetrino, assicurandosi che nessun tessuto si sia arricciato o altrimenti ribaltato su se stesso.
    nota: In alternativa, è possibile utilizzare uno strumento a filo di tungsteno per praticare piccole incisioni nel tessuto connettivo per facilitare il posizionamento appiattito del rene.
11. Posizionare piccoli pezzi di argilla da modellare su ogni angolo di un vetrino coprioggetti di vetro 18 x 18 mm e posizionare lentamente il vetrino coprioggetti sul rene.
    nota: Inclinare leggermente il vetrino coprioggetti durante il posizionamento per ridurre al minimo l'intrappolamento di bolle d'aria nella soluzione. I fori di argilla da modellare hanno un diametro di circa 2 mm (Figura 1A). In alternativa, è possibile sostituire le gocce di grasso sottovuoto al posto dell'argilla da modellare. Se necessario, aggiungere un'ulteriore goccia di 1X PBS per riempire lo spazio tra il vetrino e il vetrino.
12. Osservare e/o visualizzare il rene posizionando il vetrino nel campo visivo di uno stereomicroscopio o di un microscopio composto con il filtro appropriato.

Risultati

Figura 1. Preparazione e applicazione del rene adulto di pesce zebra per visualizzare l'assorbimento del destrano coniugato nel segmento PCT dei nefroni renali. (A)Immagine in campo chiaro di una preparazione a montaggio piatto di un campione di rene, in cui l'organo è stato posizionato in piano su un vetrino, con un vetrino coprioggetti posizionato sopra il tessuto che poggia su quattro fessure di a...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1X PBS			Prodotto diluendo 10 X PBS in acqua distillata.
Pinze fini	Roboz	RS-1050	Dumont Pinzetta Modello #55
Scivolo in vetro	Termo-Fisher	Codice: 4445	Gelo bianco
Vetrino coprioggetti in vetro	Termo-Fisher	12-540A	18 x 18 millimetri
Argilla da modellare	Hasbro	Playdoh	Altre argille da modellare possono essere sostituite e funzionano in modo simile.
Supporto per vetrini	Termo-Fisher	12-587	Opzionale: vassoio di cartone per riporre i vetrini in piano.
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blu GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/ FITC; 83457 P-TRITC	Il set di filtri utilizzato è stato il seguente: il filtro Hoechst/DAPI è stato utilizzato per il rilevamento di DAPI, ioduro di propidio, blu a cascata di destrano e fosfatasi alcalina. Il filtro GFP/FITC è stato utilizzato per il rilevamento di destrano-FITC, destrano lucifero giallo e antiGFP. Il filtro TRITC è stato utilizzato per il rilevamento di destrano-fluoro-rubino, PI e DBA.
Microscopio composto	Nikon	96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Rosso Texas	Il set di filtri utilizzato è stato il seguente: il filtro Hoechst/DAPI è stato utilizzato per il rilevamento di DAPI, ioduro di propidio, blu a cascata di destrano e fosfatasi alcalina. Il filtro GFP/FITC è stato utilizzato per il rilevamento di destrano-FITC, destrano lucifero giallo e antiGFP. Il filtro Texas Red è stato utilizzato per il rilevamento di destrano-fluoro-rubino, PI e DBA.