Depigmentazione e prestazione del rene di zebrafish: una tecnica per preparare il rene di zebrafish adulto per la colorazione

Abstract

Fonte: McCampbell, K. K. et al. Analisi della composizione e della funzione del nefrone nel rene adulto del pesce zebra. J. Vis. Exp. (2014)

In questo video, dimostriamo la depigmentazione del rene adulto di zebrafish e la sua successiva preparazione per le procedure di colorazione. Dopo la colorazione, il rene adulto di pesce zebra può essere utilizzato per studiare la rigenerazione renale, la caratterizzazione fenotipica di modelli di malattia renale e la funzionalità del nefrone.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Fissazione, dissezione, permeabilizzazione e rimozione della pigmentazione del rene adulto del pesce zebra

1. Preparare una soluzione fissativa fresca di paraformaldeide al 4% (PFA)/1X PBS/0,1% DMSO o scongelare un'aliquota congelata di PFA al 4%/1X PBS e aggiungere 0,1% di DMSO.
   ATTENZIONE: Il PFA è tossico e le soluzioni di PFA devono essere maneggiate in un cappuccio chimico indossando adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti e camice da laboratorio. Inoltre, la polvere di PFA deve essere maneggiata con cura durante la preparazione della soluzione madre.
2. Riempi un vassoio di dissezione con una soluzione fissativa sufficiente per immergere l'intero animale.
3. Eutanasia e montare il pesce zebra selezionato nella soluzione di fissaggio.
   nota: Il pesce selezionato può essere un campione di rene di zebrafish non trattato o un rene isolato da un zebrafish che ha precedentemente ricevuto un'iniezione intraperitoneale di destrano.
4. Fissare l'O/N del campione (12-16 ore) a 4 ^oC.
5. Il giorno seguente, utilizzare una pinza fine per staccare con cura il rene dalla parete dorsale del corpo e posizionare l'organo in una fiala di vetro utilizzando una pipetta di trasferimento.
   NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare una piastra di coltura a 12 o 24 pozzetti. Mentre si potrebbe utilizzare una provetta per microcentrifuga in plastica, le provette di dimensioni standard (1,5 mL) potrebbero limitare il lavaggio.
6. Lavare il rene sezionato 3 volte con 3-5 ml di PBS 1X con Tween allo 0,05% per 5 minuti ciascuno.
7. Rimuovere 1X PBS con 0,05 % Tween e sciacquare il rene con 3 mL di una soluzione di saccarosio al 5% (in 1X PBS) per 30 minuti.
8. Sostituire con 3 mL di soluzione di saccarosio al 30% (in 1X PBS) e conservare O/N (12-16 ore) a 4 ^oC.
   NOTA: Le soluzioni di saccarosio permeabilizzano le membrane cellulari, consentendo successivamente l'etichettatura specifica dei reagenti man mano che penetrano nel tessuto.
9. Il giorno seguente, rimuovere la soluzione di saccarosio al 30% e lavare il rene 2 volte con 5 ml di 1X PBS con 0,05% di Tween per 5 minuti ciascuno.
10. Sostituire 1X PBS con 0,05% Tween con 3-5 mL di soluzione sbiancante per rimuovere la pigmentazione dei melanociti presente sull'organo renale.
11. Posizionare la fiala di vetro su un rotatore e osservare attentamente la scomparsa della pigmentazione.
    NOTA: La depigmentazione richiede in genere circa 20 minuti se eseguita dopo il trattamento con saccarosio, ma occasionalmente può richiedere fino a 60 minuti. Se la soluzione sbiancante viene lasciata sul rene troppo a lungo, può verificarsi la disintegrazione dell'organo; Si consiglia di monitorare il campione ogni 10-15 minuti per verificare l'integrità dei tessuti.
12. Quando la pigmentazione è stata rimossa dal rene, lavare due volte con 3-5 ml di 1X PBS con 0,05% di Tween.
13. Sostituire 1X PBS con Tween allo 0,05% con 3-5 mL di soluzione di PFA al 4% per 1 ora a RT.
14. Rimuovere la soluzione di PFA al 4% e lavare il rene 3 volte con 3-5 ml di PBS 1X con Tween allo 0,05% per 5 minuti ciascuno.
    NOTA: Una volta completata la fissazione, il rene può anche essere montato su un vetrino e valutato per l'assorbimento del destrano senza la pigmentazione dei melanociti.
15. Rimuovere il PBS 1X con Tween allo 0,05% e sostituirlo con 3-5 ml di soluzione bloccante, quindi incubare il rene a RT nel blocco per 2 ore.
16. Al termine del blocco, passare direttamente al protocollo di colorazione selezionato.
    NOTA: Il rene può ora essere processato attraverso una o più altre procedure al fine di condurre studi di marcatura con diversi reagenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1X PBS			Prodotto diluendo 10X PBS in acqua distillata
1X PBST			Detersivo Tween-20 allo 0,1% in 1X PBS
1X PBS con 0,05 % di interpolazione			Detersivo Tween-20 0,05% in 1X PBS
Interpolazione 20	Bioanalitica americana	AB02038
4% PFA/1X PBS			Sciogliere il 4% di PFA (p/v) (Scienze della microscopia elettronica, Cat #19210) in 1X PBS, portare a ebollizione su una piastra calda in una cappa aspirante. Raffreddare e congelare le aliquote per la conservazione in congelatore a -20°C. Scongelare poco prima dell'uso e non ricongelare le scorte
Soluzione sbiancante			Formula della miscela di candeggina (per una soluzione da 20 ml): 1,6 ml di soluzione di idrossido di potassio al 10%, 0,6 ml di soluzione di perossido di idrogeno al 30%, 100 μl di Tween al 20%, riempire con acqua distillata fino a 20 ml
idrossido di potassio	sigma	221473
Perossido di idrogeno	sigma	H1009
Soluzione bloccante			Soluzione bloccante (per una soluzione da 10 ml): 8 ml di 1X PBS con 0,05% Tween 2 ml di siero fetale di vitello 150 μl di DMSO