Patologia di espansione: un metodo per l'imaging ottico ad alta risoluzione di campioni di tessuto clinico

Abstract

Source: Klimas, A. et al. Imaging nanoscopico di sezioni di tessuto umano tramite espansione fisica e isotropa.J. Vis. Exp.(2019)

In questo video, descriviamo un metodo chiamato patologia di espansione, una variante della microscopia di espansione, in cui i campioni di tessuto clinico vengono espansi chimicamente utilizzando una rete polimerica per l'esame microscopico di strutture su scala nanometrica.

Protocol

1. Polimerizzazione in situ di campioni

1. Incubare il campione in una soluzione di ancoraggio.
   1. Preparare la soluzione di ancoraggio (in genere 250 μL sono sufficienti per coprire la sezione di tessuto) diluendo la soluzione madre di AcX in 1x PBS a una concentrazione di 0,03 mg/mL per i campioni fissati con fissativi non aldeidici o 0,1 mg/mL per i campioni fissati con fissativi aldeidici, che hanno meno ammine libere disponibili per reagire con AcX.
   2. Posizionare il vetrino in una capsula di Petri da 100 mm e pipettare la soluzione di ancoraggio sul fazzoletto. Incubare per almeno 3 ore a RT o per una notte a 4 °C.
2. Incubare i campioni in soluzione gelificante.
   1. Preparare almeno 100 volte il volume in eccesso di soluzione gelificante. Per 200 μl, combinare quanto segue, nell'ordine: 188 μl di soluzione monomerica, 4 μl di soluzione madre 4HT allo 0,5% (diluizione 1:50, concentrazione finale: 0,01%), 4 μl di soluzione madre TEMED al 10% (diluizione 1:50, concentrazione finale 0,2%) e 4 μl di soluzione madre APS al 10% (diluizione 1:50, concentrazione finale 0,2%).
      NOTA: La soluzione gelificante deve essere preparata immediatamente prima dell'uso. La soluzione deve essere mantenuta a 4 °C e la soluzione APS deve essere aggiunta per ultima, per evitare una gelificazione prematura.
   2. Rimuovere la soluzione in eccesso dalla sezione di tessuto e posizionare il vetrino in una capsula di Petri da 100 mm. Aggiungere una soluzione gelificante fresca e fredda al campione e incubare la miscela sul tessuto per 30 minuti a 4 °C, per consentire la diffusione della soluzione nel tessuto.
3. Costruire una camera sul vetrino attorno al campione (Figura 1A) senza disturbare la soluzione gelificante.
   1. Realizzare distanziatori per la camera di gelificazione tagliando sottilmente pezzi di vetro di copertura con un coltello diamantato.
      NOTA: Per facilitare l'imaging post-espansione, i distanziatori devono avere uno spessore vicino al campione di tessuto per ridurre la quantità di gel bianco sopra il tessuto. Il vetro numero 1,5 può essere utilizzato per campioni clinici standard (5-10 μm). I pezzi di vetro di copertura possono essere impilati per ottenere campioni più spessi.
   2. Fissare i distanziatori su entrambi i lati del tessuto utilizzando goccioline d'acqua (~10 μL).
   3. Posizionare con cautela un coperchio di vetro sopra il vetrino, assicurandosi di evitare di intrappolare bolle d'aria sul fazzoletto (Figura 1B).
4. Incubare il campione a 37 °C in un ambiente umidificato (ad esempio una capsula di Petri chiusa con un panno umido) per 2 h.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. La camera del vetrino può essere conservata all'interno di una capsula di Petri sigillata a 4 °C.

2. Digestione del campione

1. Rimuovere il coperchio della camera di gelificazione facendo scorrere delicatamente una lama di rasoio sotto il vetrino coprioggetti e sollevando lentamente il vetrino coprioggetti dalla superficie del gel. Taglia il gel bianco attorno al fazzoletto per ridurre al minimo il volume. Tagliare il gel in modo asimmetrico per tracciare l'orientamento del gel dopo l'omogeneizzazione, poiché il campione diventerà trasparente.
   1. Diluire ProK 1:200 in tampone di digestione (concentrazione finale 4 U/mL) prima dell'uso. Preparare una soluzione sufficiente per immergere completamente il gel; un singolo pozzetto di una piastra di coltura cellulare in plastica a quattro pozzetti richiede almeno 3 mL per pozzetto.
   2. Incubare il campione in un contenitore chiuso contenente il tampone di digestione per 3 ore a 60 °C. Se il campione non si stacca dal vetrino durante la digestione, utilizzare una lama di rasoio per rimuovere delicatamente il campione.
      NOTA: Il campione deve essere completamente immerso nel tampone di digestione per evitare che il campione si secchi e posto in un contenitore coperto (piccola scatola per vetrini, pozzetto di plastica, piastra di Petri, ecc.) che può essere sigillato con pellicola.

3. Espansione del campione e imaging

1. Utilizzare un pennello morbido per trasferire il campione in 1x PBS in un contenitore compatibile con il sistema di imaging desiderato e abbastanza grande da ospitare il gel completamente espanso. Assicurarsi che il tessuto sia posizionato con il lato del campione rivolto verso il basso se si esegue l'imaging su un sistema invertito o verso l'alto se si esegue l'imaging su un sistema verticale per ridurre al minimo la distanza tra l'obiettivo di imaging e il campione. Se necessario, capovolgi il gel usando un pennello morbido.
   nota: L'illuminazione laterale di un LED può essere utilizzata per renderli visibili nel liquido. Una piastra standard a 6 pozzetti può ospitare campioni con un diametro pre-espanso inferiore a 0,6 cm. Per l'imaging su un sistema invertito è necessario utilizzare una piastra a pozzetti con fondo di vetro.
2. Lavare i campioni in 1x PBS a RT per 10 minuti. Se lo si desidera, colorare nuovamente il campione con DAPI da 300 nM poiché il processo di digestione lava via la macchia DAPI. Rimuovere la PBS e colorare con 300 nM DAPI diluito in 1x PBS per 20 minuti a RT, seguito da un lavaggio di 10 minuti con 1x PBS a RT.
   NOTA: I campioni possono essere coperti con 1x PBS e conservati a 4 °C prima di procedere alla fase successiva.
3. Per espandere i campioni, sostituire il PBS e lavare con un volume in eccesso di ddH₂O (almeno 10 volte il volume finale del gel) 3-5 volte per 10 minuti ciascuna, a RT.
   nota: Dopo il 3^{° o 4° lavaggio,} l'espansione del campione dovrebbe iniziare a stabilizzarsi. Per la conservazione, per prevenire la crescita batterica, il ddH₂O può essere integrato con azoturo di sodio (NaN₃) allo 0,002%-0,01%. In questo caso, il fattore di espansione finale viene ridotto in modo reversibile del 10%.
4. Esecuzione dell'imaging a fluorescenza utilizzando un microscopio convenzionale a campo largo, un microscopio confocale o un altro sistema di imaging a scelta.
   nota: Per evitare che i gel vadano alla deriva, il liquido in eccesso può essere rimosso dal pozzetto. I gel possono anche essere immobilizzati con agarosio a basso punto di fusione all'1,5-2%. Preparare l'agarosio a basso punto di fusione all'1,5-2% (p/v) in acqua in un contenitore 2-4 volte il volume della soluzione. Scaldare la soluzione a bagnomaria a 40 °C o in microonde per 10-20 s per sciogliere la soluzione. Pipettare l'agarosio sciolto attorno ai bordi del gel. Dopo aver lasciato indurire l'agarosio a RT o 4 °C, aggiungere acqua al campione per prevenire la disidratazione.

Results

Figura 1: Camera di gelificazione per campioni patologici. (A) Due distanziatori, come due pezzi di vetro di copertura #1,5 tagliati con un coltello diamantato, vengono posizionati su entrambi i lati del tessuto dopo aver incubato il campione in soluzione gelificante a 4 °C. I distanziatori devono essere più spessi delle fette di tessuto, per evitare la compressione ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra con fondo in vetro a 6 pozzetti (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
acetone	Fischer Scientifc	A18-500
acrilamide	Sigma Aldrich	A8887
Acriloil-X SE, (AcX)	Invitrogen	Codice A20770
agarosio	Fischer Scientifc	BP160-100
Persolfato di ammonio (APS)	Sigma Aldrich	Trasmissione A3678	Iniziatore
DAPI (1 mg/mL)	Termo Scientifico	Codice 62248	Colorazione nucleare
Coltello diamantato n. 88 CM	Strumenti generali	Codice: 31116
etanolo	Pharmco	111000200
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 0,5 M	VWR	BDH7830-1
Campione di rene FFPE	USBiomax	HuFPT072
forcipe
Micro copertura Vetro #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	Numero 48393 106
Micro copertura Vetro #1,5 (24 mm x 60 mm)	VWR	Numero 48393 251
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	acceleratore
N,N′-metilenbisacrilammide	Sigma Aldrich	Codice: M7279
Nunclon Piatto per colture cellulari a 6 pozzetti	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL conico	Thermo Fisher	339651
Nunc 50 mL Conico	Thermo Fisher	339653
Agitatore orbitale
Pennello
Misuratore di pH
salina tamponata con fosfato (PBS) 10x	Fischer Scientifc	BP399-1
Piastra Petri in plastica (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
proteinasi K (grado di biologia molecolare)	Termo Scientifico	EO0491
lametta	Fischer Scientifc	Codice 12640
Provette per microcentrifuga Safelock da 1,5 mL	Thermo Fisher	Telefono 3457
Provette per microcentrifuga Safelock 2,0 mL	Thermo Fisher	3459
Acrilato di sodio	Sigma Aldrich	Numero 408220
cloruro di sodio	Sigma Aldrich	S6191
Citrato di sodio tribasico diidrato	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris Base	Fischer Scientifc	BP152-1
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
xilene	Sigma Aldrich	214736