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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Accesso laterale della pipetta al rene sotto una colonna di imaging del fluido tramite una nuova procedura chirurgica
NOTA: L'assemblaggio del sistema di supporto all'imaging e la preparazione chirurgica sono mostrati nella Figura 1. La procedura descritta viene eseguita su topi C57BL/6 del peso di 20-25 g.
- Pesa il mouse.
- Indurre l'anestesia utilizzando isoflurano al 4% e mantenere con isoflurano all'1,5-2,5% in una miscela aria/ossigeno. Confermare che il topo è anestetizzato dall'assenza di risposta allo stimolo doloroso e dalla riduzione della frequenza respiratoria.
- Lubrificare gli occhi e posizionare l'animale lateralmente su una piastra di base. Immobilizzare 4 estremità con del nastro adesivo.
- Iniettare soluzione fisiologica, 200 μL, per via sottocutanea e posizionare una sonda di temperatura rettale. Controlla la temperatura utilizzando una lampada riscaldante durante l'intervento chirurgico e un termoforo durante l'imaging.
- Rimuovere tutti i peli sul lato sinistro del mouse utilizzando una crema depilatoria.
- Individua la milza, che è visibile sotto la pelle, e individua il rene sinistro sul lato dorsale e caudale della milza.
- Fai un'incisione di 0,5 cm sulla pelle e un'incisione più piccola sul peritoneo, quanto basta perché il rene possa passare facilmente.
- Estrudere il rene con una leggera pressione. Posizionare la forma stabilizzatrice renale in polisilossano attorno al rene e fissarla con adesivo cianoacrilato. Allineare il rene con il distanziatore in modo tale che la superficie più laterale del rene si estenda oltre lo stabilizzatore di circa 1 mm.
- Fissare una piastra di testa alla forma stabilizzatrice con la colla e montare la piastra di testa sulle barre di montaggio sulla piastra di base.
- Riempire il pozzetto del supporto polisilossanoico che circonda il rene con una soluzione di agarosio all'1% e posizionare sopra il vetrino coprioggetti da 10 mm e tenere premuto fino a quando l'agarosio non si è rassodato. Sigillare il vetrino coprioggetti alla piastra di testa con la colla e creare un anello attorno al vetrino coprioggetti con cemento dentale.
- Iniettare il FITC-destrano (2.000.000 Da, soluzione al 5%, 100-150 μL) per via retroorbitale e spostare rapidamente il mouse e la piastra di fissazione sul tavolino del microscopio a 2 fotoni, mantenendo l'anestesia e garantendo un'adeguata evacuazione dei gas di scarico sul tavolino del microscopio.
2. Selezione di un glomerulo adatto e accesso alla pipetta allo spazio di Bowman
- Definizioni:
- Definisci X come sinistra-destra sullo schermo e sinistra-destra rivolta verso il microscopio
- Leggere SX (stage X) dal controller di scena
- Definire PX come pipetta X, sul controller del quadrante della pipetta
- Definisci Y come su-giù sullo schermo e in avanti verso il microscopio e di nuovo verso la configurazione a 2 fotoni
- Definite Z come verso l'alto verso il soffitto, verso il basso verso il pavimento e misurato sul tavolino con la posizione Z dell'obiettivo.
- Definisci S(O)Z come l'altezza del palcoscenico (in realtà l'obiettivo).
- Trova la superficie del rene, identificabile utilizzando le impostazioni del filtro della proteina fluorescente verde (GFP) nell'oculare. A causa dell'iniezione di FITC-destrano, il sistema vascolare sarà di colore verde brillante.
- Identifica un glomerulo adatto. Dopo aver identificato la superficie del rene utilizzando l'oculare, passare a 2 fotoni (modalità senza scansione) ed esplorare la finestra di imaging. Le caratteristiche favorevoli per la micropuntura sono le seguenti: distanza verticale sotto il vetrino coprioggetti >30 μm (per evitare collisioni tra la pipetta e il vetrino coprioggetti durante l'accesso) e distanza laterale dalla capsula renale laterale al glomerulo <400 μm (oltre questa distanza la deviazione della pipetta può aumentare la probabilità di mancare).
- Registrare la distanza laterale e verticale dal punto di puntura, un punto sulla capsula renale direttamente sul lato della pipetta del glomerulo.
- Solleva il punto focale dell'obiettivo nella colonna d'acqua, mantenendo invariate le coordinate degli stadi x e y, solo circa un centimetro.
- Inserire la punta della pipetta nella colonna d'acqua e attivare l'eccitazione con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Spostare la pipetta nelle dimensioni x e y fino al punto di massima fluorescenza del puntale, questo sarà il centro dell'obiettivo. Trovare la pipetta nell'oculare è difficile senza questo preciso preposizionamento. Poiché i punti quantici emettono fluorescenza alla stessa lunghezza d'onda (in questo caso, rossa) indipendentemente dalla lunghezza d'onda di eccitazione, l'eccitazione DAPI produce una fluorescenza rossa, che è strettamente focalizzata sulla punta, illustrata nella Figura 2.
- Modificare l'impostazione di eccitazione in proteina fluorescente rossa (RFP) e visualizzare la pipetta nell'oculare, quindi centrarla con precisione nella vista oculare.
- Passa a 2-fotone e trova la pipetta sotto 2-fotone, posizionandola esattamente al centro dell'immagine. Questa è la posizione di registrazione.
- Salvare un'immagine della pipetta.
- Registrare il tavolino e il controller della micropipetta coordinates.
nota: Utilizzare il file di .html supplementare, che eseguirà i calcoli utilizzando il codice JavaScript (vantaggioso per i sistemi che non dispongono di un software per fogli di calcolo installato) o un foglio di calcolo per calcolare l'offset tra le coordinate del tavolino e della pipetta e per calcolare le coordinate target per il controller della pipetta.
- Rimuovere la pipetta dalla colonna d'acqua sull'asse x, mantenendo gli stessi z e y.
- Spostare la pipetta Z sul glomerulo Z target (cioè, spostare la pipetta verso il basso nella direzione Z sotto il vetrino coprioggetti)
- Spostare la pipetta Y sulla coordinata Y del glomerulo target.
- Spostare il live view a 2 fotoni sul glomerulo bersaglio Z e poi sul bordo del rene e annotare l'SX.
- Calcolare il PX del fronte renale utilizzando l'offset dalla registrazione SX.
- Spostare il tavolino verso la pipetta (aumentare l'SX) in modo che il bordo del rene sia molto a sinistra dello schermo, ma ancora visibile.
- Far avanzare rapidamente la pipetta fino a circa 100 μm in meno rispetto al PX del bordo del rene calcolato sopra.
- Individuare il puntale della pipetta, facendo avanzare lentamente la pipetta. Aumentare il guadagno del rosso e osservare l'istogramma dei pixel rossi (la distribuzione dei pixel cambia prima che la pipetta venga ripresa nella finestra, a causa dell'estrema luminosità dei punti quantici e della fluorescenza fuori bersaglio).
- Avanza verso il bordo del rene con imaging dal vivo a 2 fotoni.
nota: Prima di entrare nella capsula renale, è possibile reindirizzare la pipetta nelle dimensioni Y e Z. Tuttavia, questo potrebbe rompere il puntale della pipetta. Una misura più conservativa, se la pipetta è fuori bersaglio, consiste nel prelevare nella dimensione X fino a 2 cm, reindirizzare e quindi tornare nella dimensione X al bordo del rene. Una volta che la pipetta si trova all'interno del tessuto, il movimento su qualsiasi asse diverso da X porta alla flessione della pipetta, che richiede una grande esperienza per essere utilizzata e spesso porta alla rottura.
- Guidare lentamente la pipetta sull'asse X fino al target glom PX, tenendo d'occhio l'SX. (È utile tornare di tanto in tanto al glomerulo per vedere se si è spostato del tutto dopo l'inserimento della micropipetta).
- Quando ci si trova nella posizione corretta, documentare la posizione con un z-stack.
nota: Con la micropipetta in posizione, possono essere iniettati farmaci, proteine o traccianti fluorescenti, il fluido può essere aspirato per un'analisi successiva o possono essere misurate la pressione o la carica relativa a un altro elettrodo.
3. Aspirazione di fluido dallo spazio di Bowman
- Impostare la micropompa in modo che inietti 100 nL di perfluorodecalina in 2 minuti per garantire la pervietà della pipetta e ridurre la confusione dovuta all'ostruzione della pipetta durante l'ingresso. Ricreare l'immagine per garantire la posizione della pipetta.
- Attendere 4-6 minuti per un'ulteriore filtrazione.
- Impostare la micropompa per aspirare fino a 300 nL a una velocità fino a 50 nL/min.
nota: Con questa velocità non si osservano cambiamenti nella morfologia glomerulare, suggerendo che non altera la velocità di erogazione del fluido nello spazio durante l'aspirazione. Poiché non c'è blocco d'olio come nella micropuntura convenzionale, il recupero di questo volume, necessario per la spettrometria di massa, potrebbe includere parte della perfluorodecalina iniettata e possibilmente il fluido tubulare. Per saggi come le misurazioni con elettrodi sensibili agli ioni, la spettroscopia di fluorescenza, la reazione a catena della polimerasi e altri endpoint sensibili, possono essere utilizzati volumi inferiori. Se la spettrometria di massa non è il punto finale, è possibile utilizzare l'olio minerale e le tecniche standard di micropuntura per misurare il volume aspirato prima dello stoccaggio.
- Immagine ancora una volta.
- Estrarre la pipetta e conservare il campione, aggiungendo il tampone TRIS e conservandolo a -80° prima dell'analisi.
- Eutanasia del topo utilizzando un sovradosaggio di isoflurano o un altro metodo approvato.
nota: Il filtrato entra nello spazio per filtrazione dai capillari glomerulari. La velocità di filtrazione glomerulare a singolo nefrone (SNGFR) nei topi è riportata tra 8-14 nL/min. Le forze di Starling governano l'SNGFR, tuttavia, e la pressione idrostatica negativa nello spazio di Bowman può quindi aumentare l'SNGFR. I metodi standard di micropuntura utilizzano il blocco tubolare con olio e pressione neutra per il campionamento di fluidi tubolari, tuttavia questi composti interferiscono con la spettrometria di massa (vedi sotto); Pertanto, in questa tecnica il tubulo prossimale precoce rimane pervio. Inoltre, al momento dell'aspirazione, lo spazio di Bowman contiene un volume di filtrato sconosciuto, ma positivo. Pertanto, la velocità di aspirazione del fluido può superare SNGFR.
nota: Negli esperimenti qui descritti, l'obiettivo era quello di ottenere un campione più grande del solito di filtrato glomerulare per l'analisi della spettrometria di massa mediante tecniche nanoproteomiche. Poiché l'uso della spettrometria di massa preclude l'uso di blocchi d'olio con olio minerale o cera (miscele complesse di molecole organiche che riducono il rumore del segnale nella spettrometria di massa), la perfluorodecalina viene utilizzata per riempire la micropipetta e la siringa. La perfluorodecalina non è nota per bloccare il flusso tubulare, ma è biologicamente inerte e non interferisce con la spettrometria di massa.
