Coltura organotipica renale su CAM di pollo: una tecnica per il trapianto di espianti di rene murino su CAM di pollo per indurre la formazione di architettura vascolare renale

Abstract

Fonte: Kaisto, S. et al. Ottimizzazione dell'organoide renale e della coltura organotipica per la vascolarizzazione, lo sviluppo esteso e l'imaging microscopico migliorato. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video descrive un metodo per studiare lo sviluppo degli organi utilizzando un sistema di xenotrapianto migliorato su membrana corioallantoica (CAM) da embrioni di uccelli. Questo metodo consente lo sviluppo di organi embrionali e organoidi in coltura completamente vascolarizzati.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE

1. Fabbricazione di miniserbatoi per la coltivazione di reni embrionali di topo e organoidi renali su CAM di pollo e impostazione di esperimenti di xenotrapianto

1. Utilizzare inserti per colture cellulari transwell progettati per piastre a 6 o 12 pozzetti.
   nota: A seconda dell'esperimento particolare, possono essere utilizzati miniserbatoi grandi o piccoli. È meglio utilizzare piccoli miniserbatoi per xenotrapianti fino a otto reni embrionali o quando diversi miniserbatoi verranno posizionati sullo stesso embrione di pollo (ad esempio, campioni di esperimento e controllo sullo stesso CAM di pollo).
2. Tagliare i lati degli inserti utilizzando un multiutensile rotante con una lama per sega circolare o una sega a mano per creare un anello di plastica alto 2 mm con una membrana permeabile attaccata ad esso.
3. Lucida i bordi di questi miniserbatoi con un bisturi o un coltello affilato.
4. Sterilizzare i miniserbatoi in etanolo al 70% per almeno 1 ora.
5. Lavare i miniserbatoi in acqua bidistillata autoclavata e lasciarli asciugare in cappa laminare.
6. Sciacquare i miniserbatoi in PBS e terreno di coltura (DMEM ad alto contenuto di glucosio/10% FBS/1% penicillina-streptomicina).
7. Collocare il serbatoio in una capsula di Petri, sopra una goccia (600 μL/400 μL) di terreno di coltura con la membrana rivolta verso l'alto.
8. Disporre i reni embrionali ex vivo sezionati o gli organoidi renali in modo uniforme sulla membrana con l'aiuto di una pipetta o di un tubo capillare di vetro. Evita di lasciare molto liquido intorno ai reni.
9. Lasciare che i campioni si attacchino alla membrana per 2-24 ore in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di CO₂,
   nota: Sul piccolo inserto possono essere disposti fino a otto reni embrionali di topo E11.5 o organoidi renali. L'inserto di grandi dimensioni è raccomandato se per lo xenotrapianto verranno utilizzati pezzi più grandi di tessuto embrionale o una miscela di cellule e idrogel su un'area più ampia della CAM.
10. Estrarre dall'incubatore per colture cellulari polli embrionali coltivati ex ovo di 8 giorni preparati secondo metodi precedentemente pubblicati
11. Trasferire i miniserbatoi al CAM in modo che gli innesti siano rivolti verso il CAM e la membrana li sovrapponga. Posizionare i miniserbatoi nella periferia del CAM in modo che non coprano l'embrione di pollo.
    nota: Quando si utilizzano i miniserbatoi più piccoli fabbricati con inserti per pozzetti per piastre a 12 pozzetti, è possibile posizionare fino a tre miniserbatoi su un CAM.
12. Aggiungere 500 μl (inserto a 6 pozzetti) o 300 μl (inserto a 12 pozzetti) di terreno di coltura ai miniserbatoi.
13. Coltivare i campioni su CAM di pollo per un massimo di 9 giorni. Sostituire quotidianamente il terreno di coltura nei miniserbatoi.
    nota: La vascolarizzazione dei campioni può essere osservata già 24-48 ore dopo il trapianto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
incubatore cellulare	Pananica	13090543	Temperatura impostata a 37° C, 90% di umidità, 5% di CO₂
incubatore cellulare	SANYO	10070347	Incubatrice di colture CAM per polli. Temperatura impostata a 37° C, 90% di umidità, 5% di CO₂
Medium dell'aquila modificata di Dulbecco	sigma	D777	Glicemia alta
Etanolo (70%)	VWR
Siero fetale bovino	HyClone	SH3007003HI Thermo Scientific
Pinze DUMONT #5	Dumont	#5SF
Pbs-/-	Corning	20-031-CV
PBS +/+	Bioovest	X0520-500	Lavaggio dei mini serbatoi.
Penicillina e streptomicina	sigma	P4333
Inserti per colture cellulari Thincert a 12 pozzetti con membrana in polistirene con pori da 0,4 μm	Greiner Bio-One	665641
Inserti per colture cellulari Thincert a 6 pozzetti con membrana in polistirene con pori da 0,4 μm	Greiner Bio-One	Codice 657610