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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Prepara Unità Stereotassiche per la Chirurgia
- Accendi tutte le macchine per anestesia, le bilance digitali a corsoio e gli iniettori digitali.
nota: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere adeguatamente puliti e sterilizzati prima dell'intervento chirurgico.
- Utilizzare macchine per anestesia con una camera di induzione in una cabina di sicurezza biologica (Figura 1A).
- Assicurarsi che tutti i tubi delle macchine per anestesia siano collegati ai telai stereotassici (Figura 1B, riquadro 1C) e che i morsetti sui tubi siano aperti per tutte le unità utilizzate. Chiudere eventuali morsetti sui tubi che vanno ai telai stereotassici che non verranno utilizzati per la chirurgia.
- Impostare le macchine per anestesia sulla portata del cono nasale consigliata dal produttore in base al peso del mouse (ad esempio, 25 g di peso dell'animale: portata del cono nasale 34 ml/min).
nota: Il supporto per la testa incluso in questa configurazione stereotassica è consigliato solo per topi adulti. Assicurarsi che vengano seguite le raccomandazioni del produttore incluse nella configurazione stereotassica.
- Assicurarsi che l'anestetico appropriato (ad es. isoflurano) preriempito nella siringa sia collegato alla macchina per anestesia (Figura 1B).
nota: L'eccessivo adescamento della siringa può causare l'erogazione di troppa anestesia ai topi durante l'intervento chirurgico e provocare un sovradosaggio di anestetico.
- Preparare i trapani ruotando il blocco del tavolino, inserendo un adattatore per punta da trapano e una punta da 1 mm in ciascun trapano e bloccare il trapano serrando manualmente il blocco della punta.
- Fissare i trapani sui telai stereotassici (Figura 1C).
2. Posiziona i Topi su Schemi Stereotassici
- Anestetizzare i topi (ad es. isoflurano) utilizzando la suddetta camera di induzione.
- Mantenere i topi durante la procedura su un piano anestetico profondo. La % di anestesia somministrata dalla macchina dipende da una serie di fattori tra cui: portata, grado di stimolazione e temperatura corporea. Monitorare frequentemente i topi durante la procedura per la profondità dell'anestesia valutando la respirazione ritmica (l'animale non ansima); mancanza di riflesso palpebrale (svolazzamento delle palpebre quando stimolato con un applicatore con punta di cotone); e mancanza di pizzicamento delle dita dei piedi (ritiro dell'arto sotto lo stimolo nocivo di pizzicare le dita dei piedi).
nota: Diversi ceppi di topi avranno una risposta diversa all'anestesia.
- Dopo che i topi si sono posizionati su un piano anestetico profondo e appropriato, trasferire i topi all'unità stereotassica. Utilizzare un termoforo mentre il mouse è sulla macchina stereotassica per mantenere la temperatura corporea e un piano anestetico appropriato.
nota: Per ottenere un profilo basso, utilizziamo scaldamani attivati ad aria posizionati all'interno di una scatola di puntali per pipette rovesciata (scatola di sollevamento del mouse nella Figura 1D).
- Aprire la bocca del topo e posizionare i denti nella depressione della barra della bocca situata sul nasello sul telaio stereotassico (Figura 2A). Far scorrere il cono del naso sul naso/bocca del topo (Figura 2B).
- Posiziona i topi con la testa all'altezza della barra della bocca. Aprire delicatamente la bocca con l'estremità smussata di un applicatore con punta di cotone e farla scorrere in posizione. Assicurarsi che il cono del naso sia completamente sopra il naso del topo o l'anestesia non verrà erogata correttamente. Il cono del naso non si innesterà con il naso se i denti non sono posizionati all'interno di questa scanalatura (Figura 2A nel riquadro).
- Usando un batuffolo di cotone sterile, metti del lubrificante per gli occhi su ciascuno degli occhi del topo. L'applicazione di lubrificante oculare mitiga l'essiccazione della cornea e riduce la possibilità di danni corneali e complicanze postoperatorie legate al trauma corneale.
- Stabilizza il cranio del topo premendo la barra dell'orecchio sinistro contro il canto mediale dell'orecchio sinistro, bloccandolo in posizione utilizzando la vite sul telaio stereotassico. Quindi, far scorrere la barra auricolare destra contro il canto mediale dell'orecchio destro e avvitare saldamente il telaio stereotassico (Figura 2B).
nota: Assicurati che la testa del mouse sia livellata e dritta quando posizioni le barre auricolari. Se la testa è storta o angolata, l'iniezione sarà nel punto sbagliato del cervello. Le barre auricolari devono essere strette SOLO fino a quando il cranio non viene immobilizzato dopo la stimolazione con un sondaggio manuale moderato.
3. Crea una finestra calvariale
- Preparare e pulire il cuoio capelluto con 3 passaggi alternati ciascuno di una soluzione di betadina ed etanolo al 70%. A causa della vicinanza del sito chirurgico agli occhi, utilizzare la soluzione di betadina sopra lo scrub chirurgico.
- Utilizzando un bisturi sterile, praticare un'incisione di 3 mm attraverso la pelle lungo la faccia mediana centrale del cranio (seguendo la linea di sutura sagittale). Il sanguinamento all'incisione dovrebbe essere minimo. In tal caso, applicare una pressione costante e decisa sul sito di sanguinamento con un applicatore di cotton fioc sterile per >30 secondi.
- Identificare e orientare la fresa perpendicolarmente alla bregma (Figura 2C), assicurandosi di azzerare la scala digitale del nonio.
- Spostare la fresa di 2 mm lateralmente alla sutura sagittale e di 1 mm anteriormente alla sutura coronale (Figura 2C). Per la riproducibilità, assicurarsi che la posizione a sinistra o a destra della linea di sutura sagittale rimanga coerente per tutti gli animali.
- Ruotare il trapano alla massima velocità. Assicurarsi che la pelle sia allontanata dal trapano per evitare danni ai tessuti causati dalla punta rotante e avviare con cautela il trapano sul cranio. Praticare un foro profondo circa 0,5 mm attraverso la calvaria, ottenendo la finestra calvariale. Fai attenzione a non abbassare troppo il trapano o ti trapanerà il cervello. Far cadere soluzione fisiologica sterile nel sito di perforazione mentre la fresa è in movimento può compensare il calore generato dalla macchina che può causare danni termici al tessuto circostante.
- Una volta realizzata la finestra calvariale, sollevare con cautela il trapano e rimuoverlo dal telaio stereotassico.
- Pulire le punte del trapano con etanolo al 70% e metterle da parte se vengono riutilizzate. In caso contrario, rimuovere le punte del trapano e immergerle in etanolo al 70%.
