Saggio di fagocitosi microgliale: un test in vitro per stabilire un modello di fagocitosi microgliale per le cellule di neuroblastoma utilizzando i macrofagi iPSC

Abstract

Fonte: Hall-Roberts, H. et al. Saggio di imaging quantitativo in vitro per la fagocitosi delle cellule morte di neuroblastoma da parte di iPSC-Macrofagi. J. Vis. Exp. (2021)

In questo video, eseguiamo il test di fagocitosi microgliale per il neuroblastoma utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte. Il test aiuta a valutare la compromissione della funzione microgliale nelle malattie neurodegenerative.

Protocollo

1. Etichettatura di SH-SY5Ys morti con colorante fluorescente rosso sensibile al pH

1. Iniziare con celle SH-SY5Y fissate sospese in terreni tamponati HEPES privi di rosso fenolo. Contare le cellule e rimuovere il numero totale di cellule necessarie in una provetta da 2 mL a basso legame proteico. Per ogni 1 milione di SH-SY5Ys, comporre il volume totale nella provetta da 2 mL a 300-500 μL con terreni tamponati HEPES privi di rosso fenolo. Scaldare brevemente il tubo a bagnomaria a 37 °C.
2. Ricostituire l'estere STP del colorante fluorescente rosso sensibile al pH (vedere la Tabella dei materiali) e aggiungere 12,5 μg di colorante per milione di SH-SY5Y alla provetta calda da 2 mL di cellule. Miscelare delicatamente pipettando. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 30 minuti, al riparo dalla luce.
   nota: La specie estere STP del colorante sensibile al pH reagisce con le ammine primarie e, pertanto, il tampone di marcatura non deve contenere ammine libere. A causa della solubilità potenzialmente limitata nei tamponi acquosi, aggiungere il colorante disciolto in DMSO solo per riscaldare il tampone acquoso, mescolare immediatamente ed esaminare la presenza di segni di precipitato (particelle scure al microscopio ottico).
3. Aggiungere 1 mL di HBSS e centrifugare a 1200 x g per 7 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante e lavare con 2 mL di HBSS. Ripetere la centrifugazione.
4. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in terreni macrofagici privi di rosso fenolo (vedi Tabella dei materiali) a una concentrazione di 200.000-1,2 milioni di cellule/mL in modo che 50 μL siano 10.000-60.000 cellule (cioè, 0,5x-3x più SH-SY5Ys rispetto ai macrofagi iPSC).
   nota: Il rosso fenolo nei terreni aumenta la fluorescenza di fondo e, pertanto, se si deve eseguire l'imaging su cellule vive, è necessario utilizzare terreni privi di rosso fenolo. Si sconsiglia di conservare l'SH-SY5Ys macchiato per più di qualche ora, in quanto non è stato valutato. Tenere gli SH-SY5Ys macchiati sul ghiaccio e proteggerli dalla luce.

2. Colorazione dei macrofagi iPSC

1. In una cappa di sicurezza biologica, preparare una soluzione in terreno macrofagico di un colorante fluorescente di colore rosso intenso, permeante alle cellule, reattivo all'estere succinimidil (vedere la Tabella dei materiali). Aggiungere Hoechst 33342 (vedi Tabella dei materiali). Riscaldare la soluzione di lavoro a 37 °C a bagnomaria.
2. Aspirare delicatamente il terreno iPSC-macrofago pipettando il surnatante cellulare con una pipetta multicanale in un serbatoio sterile. Aggiungere 70 μL/pozzetto della soluzione colorante preparata al punto 2.1 ai macrofagi iPSC, utilizzando una pipetta multicanale. Incubare per 1 ora a 37 °C e 5% CO₂.
3. Preparare trattamenti sperimentali in terreni macrofagici privi di rosso fenolo. Includere 10 μM di citocalasina, D come trattamento di controllo negativo. Dopo l'incubazione, aspirare il terreno iPSC-macrofago molto delicatamente con una pipetta multicanale e aggiungere 100 μL/pozzetto di soluzione salina tamponata di Hank (HBSS), per il lavaggio. Rimuovere immediatamente l'HBSS con un pipettaggio delicato, quindi aggiungere 100 μl di terreno ± composti. Incubare per 10 minuti–1 ora a 37 °C e 5% CO₂,
   nota: La citocalasina D è un potente inibitore dell'actina e blocca la fagocitosi. Per tutti i trattamenti sperimentali che richiedono un'incubazione più lunga, ad esempio 24-72 ore, eseguire il trattamento sperimentale prima della fase 2.1, utilizzando 100 μL/pozzetto di trattamento in terreno completo per macrofagi. Seguire i passaggi 2.1-2.3 secondo il protocollo in modo da eseguire la colorazione cellulare e successivamente il trattamento viene riapplicato in terreni macrofagici privi di rosso fenolo per il resto del test di fagocitosi.

3. Fagocitosi per immagini

1. Imaging ad alto contenuto a celle fisse
   1. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 50 μl di SH-SY5Ys marcato per pozzetto, aggiungendo al lato di ciascun pozzetto sul bordo del liquido. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 3-5 ore.
   2. Dopo l'incubazione della fagocitosi, aspirare delicatamente i surnatanti cellulari pipettandoli con una pipetta multicanale e gettarli. Lavare una volta con 100 μL di PBS.
   3. Fissare la piastra con l'aggiunta di 100 μl di paraformaldeide al 2% e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
   4. Aspirare i pozzetti e aggiungere 100 μL di PBS. Coprire con sigillante per piastre e pellicola; conservare a 4 °C fino al momento del bisogno.
      nota: La piastra di analisi può essere conservata in questo modo per almeno una settimana senza una significativa degradazione del segnale; Non è stata testata una memoria più lunga.
   5. Accendere il microscopio per immagini ad alto contenuto (vedere Tabella dei materiali) e aprire il software di acquisizione delle immagini. Caricare la piastra del saggio nel microscopio facendo clic sull'icona Carica nella parte superiore dello schermo.
   6. Selezionare la scheda Configurazione. Nei menu a discesa della casella in alto a sinistra: selezionare il tipo di piastra appropriato, selezionare l'opzione di messa a fuoco automatica Two Peak (predefinita), selezionare l'obiettivo 40x Acqua, NA1.1, selezionare la modalità confocale e selezionare il binning di 1.
   7. Sciacquare l'obiettivo dell'acqua 40x prima dell'uso tramite il menu Impostazioni.
   8. Nella casella Selezione canale, utilizzare l'icona + per aggiungere i canali DAPI, Alexa 647 e Alexa 568. Impostarli in modo che vengano misurati su un singolo piano di 1 μm. Ottimizza le impostazioni di tempo e potenza per l'efficienza di colorazione della piastra di saggio.
      nota: Come linea guida, imposta DAPI a 200 ms di esposizione e 100% di potenza, Alexa 647 a 1500 ms di esposizione e 100% di potenza e Alexa 568 a 100 ms di esposizione e 40% di potenza.
   9. Assicurarsi che i canali non vengano misurati contemporaneamente facendo clic su Sequenza canali per separare i canali.
   10. In Navigazione | Definisci il layout, seleziona i pozzetti di misurazione e seleziona 9-12 campi per pozzetto.
   11. Durante la configurazione, fare clic su un campo rappresentativo sulla mappa della lastra e controllare a turno ciascun canale di misurazione, per assicurarsi che la colorazione sia presente e che le immagini siano a fuoco, regolando l'offset del canale.
   12. Per caricare i dati su un server per l'analisi remota, fare clic sulla casella Lavori online e sul nome della schermata pertinente; ciò consentirà il caricamento automatico dei dati su un server dopo l'imaging.
   13. Salvare il protocollo del test facendo clic sul pulsante Salva.
   14. Fai clic sulla scheda Esegui esperimento in alto e assegna un nome alla piastra dell'esperimento, quindi fai clic su Avvia.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta da centrifuga conica da 15 mL	Falcone	352096	Per la centrifugazione di cellule
Micropipette monocanale da 2-20 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL
4% di paraformaldeide nel PBS	Alfa Aesar	J61899	Per il fissaggio delle cellule
piastra a 6 pozzetti, trattamento per coltura tissutale
Piastra a 24 pozzetti AggreWell-800	Tecnologie STEMCELL	Codice: 34815	Piastra Microwell a 24 pozzetti a bassa aderenza per la formazione di corpi embrioidi
Contatore di celle automatizzato
Centrifuga da banco
Microcentrifuga da banco
CellCarrier-96 Ultra Micropiastre, trattate per coltura tissutale, nere, 96 pozzetti con coperchio	Perkin Elmer	6055302	Micropiastra trattata con coltura tissutale (TC) a 96 pozzetti con pareti nere e fondo otticamente trasparente, per saggi di fagocitosi
Software CellProfiler			Software open-source per l'analisi di immagini di fagocitosi ottenute al microscopio time-lapse su cellule vive. Scarica gratuitamente dal sito web (http://cellprofiler.org/), questo protocollo utilizzato versione 2.2.0.
CellTracker Colorante rosso intenso	Thermo Fisher	Codice C34565	Colorante fluorescente di colore rosso intenso, permeante alle cellule, reattivo all'estere succinimidilico per la colorazione del citoplasma dei macrofagi iPS. Sciogliere il colorante CellTracker Deep Red in DMSO a 2 mM (1,4 mg/mL). Utilizzare a 1 μM, mediante diluizione del materiale DMSO con terreni macrofagici.
Cabina di sicurezza a flusso d'aria laminare di classe 2
Bombola di gas CO2			Accessorio per EVOS FL Auto
Incubatore a CO2, impostato a 37°C e 5 % di CO2
Citocalasina D	caimano	Codice: 11330	Trattamento di controllo negativo per il test di fagocitosi. Ricostituire in DMSO a 10 mM e conservare le aliquote a -20°C, evitando ulteriori cicli di gelo-disgelo. Utilizzare alla concentrazione finale 10 μM.
DMEM/F12	Gibco	11320074	Componente del supporto SH-SY5Y
Dmso	sigma	D8418	Solvente per coloranti CellTracker e pHrodo
Siero fetale bovino	sigma	F4135	Componente del supporto SH-SY5Y
Matrice a membrana basale Geltrex LDEV-Free, qualificata hESC, a fattore di crescita ridotto	Invitrogen	A1413302	Matrice di membrana basale qualificata hESC per coltura iPSC
Integratore GlutaMAX	Gibco	Codice 35050-038	Componente di terreni di fabbrica e macrofagi
S.b.B	Lonza	BE 10-547F	La soluzione salina bilanciata di Hank per le fasi di lavaggio
IL-3 ricombinante umana	Gibco	PHC0033	Componente di terreni di fabbrica e macrofagi
Soluzione di imaging di cellule vive	Thermo Fisher	A14291DJ	Terreni tamponati HEPES privi di rosso fenolo per l'etichettatura di SH-SY5Ys morti
Provette da 2 mL a basso legame proteico	Eppendorf	Codice 30108.132	Per la colorazione SH-SY5Ys
M-CSF	Thermo Fisher	PHC9501	Componente di terreni di fabbrica e macrofagi
mTeSR1 Medio	Tecnologie STEMCELL	Codice 85850	Supporti iPSC
Pipetta multicanale 20-200 uL			Per la manipolazione di liquidi di piastre a 96 pozzetti
Reagente NucBlue Live ReadyProbes	Thermo Fisher	R37605	Formulazione Hoechst 33342 in flacone contagocce per la colorazione di nuclei di iPS-macrofagi, utilizzare 0,5 gocce/mL in terreni Macrofagi.
Sistema di screening ad alto contenuto Opera Phenix	Perkin Elmer	HH14000000	Microscopio per immagini ad alto contenuto, utilizzato con il software Harmony versione 4.9.
Penicillina-Streptomicina	Gibco	Codice: 15140-122	Componente di terreni di fabbrica, macrofagi e SH-SY5Y
pHrodo iFL Rosso STP-Estere	Thermo Fisher	P36011	Colorante fluorescente rosso sensibile al pH per l'etichettatura di SH-SY5Ys morti. Ricostituire la polvere di estere rosso STP pHrodo iFL in DMSO a una concentrazione di 5 mg/mL. Per ogni 1 milione di SH-SY5Ys, aggiungere 2,5 μl (12,5 μg) di pHrodo iFL Red STP Ester stock alle cellule preriscaldate sospese nella soluzione di imaging di cellule vive.
Pipetta di riempimento sierologica
Pallone T175, trattamento con coltura tissutale			Recipiente per la differenziazione dei precursori dei macrofagi iPSC, noto come "Fabbriche"
Pallone T75			Recipiente per coltura SH-SY5Y
Sigillanti per lastre trasparenti	Greiner Bio-One	676001	Per lo stoccaggio e il trasporto delle piastre di analisi
Bagnomaria, impostato a 37°C
X-VIVO 15 Medium con L-glutammina, gentamicina e rosso fenolo	Lonza	BE04-418F	Componente di terreni di fabbrica e macrofagi
X-VIVO 15 Medium con L-glutammina; senza gentamicina o rosso fenolo	Lonza	04-744Q	Terreni macrofagici privi di rosso fenolo, per l'uso in fagocitosi senza additivi o fattori di crescita

.