Isolamento di nuclei da tessuti di glioma freschi congelati: un metodo per ottenere nuclei intatti da campioni di tumore di glioma

Abstract

Fonte: Narayanan, A. et al. Isolamento dei nuclei da tumori cerebrali freschi congelati per RNA-seq a nucleo singolo e ATAC-seq. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video descrive il protocollo per isolare singoli nuclei da un tessuto di glioma fresco congelato. I singoli nuclei isolati possono essere utilizzati come campioni per tecniche di sequenziamento come il sequenziamento di RNA a singoli nuclei (snRNA) e il saggio a singolo nucleo per il sequenziamento della cromatina accessibile alla trasposasi (snATAC) per ottenere informazioni più approfondite sull'eterogeneità inter- e intra-tumorale osservata nel glioma dei tessuti nervosi centrali.

Protocollo

1. Dissezione e dissociazione dei tessuti

1. Trasferire un campione di tessuto fresco congelato (10-60 mg) in una piastra di Petri pre-raffreddata. Tritare/tritare il fazzoletto fresco congelato con una lama di rasoio a pezzetti su ghiaccio.
2. Aggiungere 500 μl di tampone di lisi dei nuclei raffreddati a una provetta pre-raffreddata da 1,5 mL. Posizionare i pezzi di tessuto nella provetta da 1,5 ml contenente il tampone di lisi dei nuclei e trasferirli in un Douncer (Tabella dei materiali).
   nota: Ci sono due pestelli omogeneizzatori Dounce: pestello "sciolto" o "A" per la riduzione iniziale del campione e pestello "stretto" o "B" per l'omogeneizzazione completa del campione.
3. Schiacciare i pezzi di tessuto con il pestello "sciolto" per circa 20 colpi, fino a quando l'attrito non si riduce. Se sono presenti detriti, il campione può essere pre-eliminato mediante filtrazione con un filtro da 100 mm.
4. Tamponare con il pestello "stretto" per 20 colpi per ottenere una completa omogeneizzazione dei tessuti.
5. Trasferire l'omogeneizzato (circa 500 μl) in una provetta da 2 mL pre-raffreddata. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi refrigerato. Mescolare delicatamente e incubare con ghiaccio per 5 minuti. Mescolare delicatamente con un puntale per pipetta a foro largo e ripetere 1-2 volte durante l'incubazione.
6. Filtrare l'intero omogeneizzato utilizzando un filtro a rete da 30 μm, raccoglierlo in una provetta Falcon da 15 mL e trasferirlo nuovamente in una nuova provetta da 2 mL pre-raffreddata. Un singolo filtro è in genere sufficiente per l'intero omogeneizzato.
7. Controllare al microscopio ottico per verificare la rimozione di detriti di grandi dimensioni e l'integrità della membrana nucleare. I nuclei devono essere rotondi e la membrana nucleare non deve essere distorta. Se sono presenti detriti, i nuclei possono essere rifiltrati.
8. Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 minuti a 4 °C su una centrifuga da banco. Rimuovere il surnatante, lasciando dietro di sé ~50 μL con un pellet contenente i nuclei. Risospendere delicatamente il pellet in un altro 1 mL di tampone di lisi nucleica e incubare per 5 minuti con ghiaccio.
9. Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 minuti a 4°C. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet, aggiungere 500 mL di 1x tampone di omogeneizzazione (HB) (Tabella 1) e incubare per 5 minuti senza risospensione. Quindi, risospendere i nuclei in un altro 1,0 mL di 1x HB.
10. Centrifugare i nuclei a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente i nuclei in 200 μl di 1x HB in una nuova provetta da 2,0 mL.

    Tabella 1: Preparazione di 1 soluzione instabile di tampone di omogeneizzazione (2 mL per campione)

    1x Soluzione instabile tampone di omogeneizzazione (2 mL per campione)
    Reagente	Conc. finale	Vol per campione (μL)
    6x tampone di omogeneizzazione instabile	1x	333,33
    1 M di saccarosio	320 mM	640,00
    50 mM EDTA	0,1 mM	Ore 4.00
    10% NP40	0,1%	Ore 20.00
    H2O		1006,27

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-mercaptoetanolo	sigma	Motore M6250
CaCl2	sigma	21115-100ML
EDTA (0,5 m)	Termo Scientifico	R1021
Provette da centrifuga coniche Falcon 15 mL	Fisher Scientifico	352096
Filtri MACS SmartStrainer (100 μm)	Miltenyi Biotec	Codice 130-098-463
Mg(Ac)2	sigma	63052-100ML
NP-40	Abcam	ab142227
Kit di isolamento dei nuclei: Nuclei EZ Prep	sigma	NUC101-1KT
Provette con blocco di sicurezza da 1,5 mL	Eppendorf	30120086
Provette Safe Lock 2,0 mL	Eppendorf	30120094
saccarosio	sigma	S0389
Puntali per pipette a foro largo (1000 μl)	Themo Fisher Scientifico	2079GPK