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1. Centrifugazione in gradiente
- Aggiungere 200 μl di soluzione di iodixanolo al 50% (Tabella 1) per ottenere una concentrazione finale di iodixanolo al 25%. Mescolare bene 10 volte con una pipetta impostata su 300 ml.
- Aggiungere 300 μl di soluzione di iodixanolo al 29% (Tabella 2) sotto la miscela al 25%. Utilizzare una punta fine P1000 per evitare di mescolare gli strati.
- Aggiungere 300 μl di soluzione di iodixanolo al 35% (Tabella 3) sotto la miscela al 29%. Utilizzare una punta fine P1000 per evitare la miscelazione degli strati.
cautela: Questa fase richiede la rimozione graduale del puntale della pipetta durante il pipettaggio per evitare uno spostamento eccessivo del volume.
- Posizionare i campioni in una centrifuga a secchiello oscillante, centrifugare per 20 minuti a 3.500 x g a 4°C con il freno disattivato.
- Rimuovere delicatamente i campioni senza agitarli e osservare alla luce. Una chiara banda bianca di nuclei puri al 95% dovrebbe essere visibile tra il secondo e il terzo strato (Figura 1).
2. Isolamento dei nuclei
- Aspirare gli strati superiori fino a quando i nuclei bianchi si stringono all'interfase del 29%-35%.
- Raccogliere la banda dei nuclei in un volume di 200 mL, trasferirla in una provetta nuova e filtrare con un filtro da 20 μm (Tabella dei materiali).
nota: I nuclei non devono essere risospesi prima della filtrazione.
- Controllare al microscopio ottico per verificare la rimozione di detriti di grandi dimensioni e l'integrità della membrana nucleare. I nuclei devono essere rotondi e la membrana nucleare non deve essere distorta.
- Contare i nuclei utilizzando la colorazione con blu di tripano su un emocitometro e aliquotare i nuclei per snRNA-seq/snATAC-seq.
Tabella 1: Preparazione di 6x Omogeneizzazione Buffer Stable Master Mix
| 6x Tampone di Omogeneizzazione Miscela Master Stabile |
| Reagente | Conc. finale | Vol per 100 (mL) |
| 1 M di CaCl₂ | 30 mM | 3.0 |
| 1 milione di mg(ac)₂ | 18 mM | 1.8 |
| 1 M Tris pH 7,8 | 60 mM | 6,0 |
| H₂O | | 89,2 |
| Mantenere a temperatura ambiente, evitare l'esposizione diretta alla luce |
Tabella 2: Preparazione del saccarosio 1 M
| 1 M di saccarosio |
| 34,23 g di saccarosio |
| Sciogliere in 78,5 mL di acqua |
| Riempire fino a 100 ml con acqua |
Tabella 3: Preparazione di 6 tamponi di omogeneizzazione Soluzione instabile (650 μL per campione)
| 6x Soluzione instabile tampone di omogeneizzazione (650 ml per campione) |
| Reagente | Conc. finale | Vol per campione (μL) |
| 6x tampone di omogeneizzazione stabile | 6x | 648,84 |
| 100 mM PMSF (fluoruro di fenilmetilsulfonil) | 0,1 mM | 1.08 |
| 14,3 M β-mercaptoetanolo | 1 mM | 0,08 |
