Crioconservazione del cervello murino mediante congelamento rapido: una tecnica per congelare rapidamente un intero campione di cervello di topo per l'analisi istologica

Abstract

Fonte: Comba, A. et al. Microdissezione a cattura laser delle sottoregioni del glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratumorale, degli oncostream e dell'invasione. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra la crioconservazione del cervello di un topo per isolare aree anatomiche discrete o specifiche popolazioni cellulari dai tessuti tumorali. Questa tecnica è fondamentale per ottenere una risoluzione ottica ottimale della morfologia del tessuto cerebrale per la successiva analisi.

Protocollo

1. Crioconservazione di cervelli che ospitano tumori gliomici

1. Prima di crioconservare il cervello, preparare un barattolo riempito con isopentano/2-metilbutano freddo e metterlo in un contenitore riempito con azoto liquido. Lasciare raffreddare il solvente.
2. Togliete il cervello dalla soluzione di saccarosio al 30% e asciugatelo su una carta da filtro.
3. Etichetta il criopoldo con un pennarello indelebile. Aggiungere con cautela circa 5 mL di OCT (composto per la temperatura di taglio ottimale) al centro del criomold evitando bolle d'aria.
4. Posizionare il cervello in un criomold contenente OCT con l'orientamento desiderato. Riempi lo stampo con OCT fino a quando il cervello non è completamente sommerso. Utilizzando una pinza pulita, posizionare rapidamente il criomold con OCT e il cervello nel freddo isopentano / 2-metilbutano.
5. Una volta che l'OCT si solidifica (~30–40 s), rimuovete il criomold con il cervello e mettetelo in ghiaccio secco. Non lasciare lo stampo contenente il cervello in 2-metilbutano oltre i 2 minuti poiché ciò potrebbe causare crepe nell'OCT solido. Avvolgere il criomold con il cervello in un foglio di alluminio e conservarlo a -80 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Staccare gli stampi per incorporamento usa e getta	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 70182
Criostato di ricerca	Leica	CM3050s
Composto Tissue-Plus O.C.T.	Fisher Scientifico	23-730-571