Sezionamento del tessuto cerebrale del topo congelato: una procedura per ottenere sottili sezioni di tessuto congelato dal tessuto cerebrale murino congelato

Abstract

Fonte: Comba, A. et al. Microdissezione a cattura laser delle sottoregioni del glioma per la caratterizzazione spaziale e molecolare dell'eterogeneità intratumorale, degli oncostream e dell'invasione. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo il sezionamento di un tessuto tumorale cerebrale di topo congelato utilizzando un criostato. Le sezioni di tessuto cerebrale congelate così ottenute vengono conservate a basse temperature fino a ulteriori analisi.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Sezionamento dei tessuti tumorali cerebrali congelati

1. Etichettare i vetrini da 2 μm di polietilene naftalato (PEN) con le informazioni sul campione. Le sezioni di tessuto saranno posizionate direttamente su questi vetrini dopo il sezionamento.
2. Impostare la temperatura della camera del criostato tra -20 e -24 °C. Prima del sezionamento, posizionare il blocco del campione nella camera del criostato e lasciarlo equilibrare alla temperatura nella camera per 30-60 minuti.
3. Pulire la camera del criostato e il portacoltello con etanolo al 100% e spruzzare le spazzole da utilizzare con la soluzione detergente RNase. Lavorando all'interno della camera del criostato, rimuovere lo stampo e attaccare il blocco OCT contenente il cervello al disco del campione del criostato con OCT. Posizionare il blocco nel supporto del disco e allineare il blocco con la lama del coltello.
4. Installare una lama usa e getta nel supporto di sezionamento.
5. Sezionare il cervello a 10 μm di spessore. Assicurati che non ci siano striature o linee di graffio nel tessuto. Usando un pennello, appiattire e srotolare con cautela il fazzoletto sulla superficie di taglio.
6. Montare con cura il tessuto contenente le sezioni cerebrali su vetrini PEN privi di RNasi. Capovolgere i vetrini caricati positivamente con le dita in direzione del tessuto e premere delicatamente il vetrino verso il basso verso la sezione del tessuto.
   nota: La temperatura delle mani aiuterà il tessuto ad attaccarsi al vetro.
7. Dopo aver montato le sezioni cerebrali sui vetrini, conservare i vetrini in una scatola all'interno della camera del criostato e poi conservarli a -80 °C. Non conservare mai i vetrini a temperatura ambiente.
   nota: Il piegamento del tessuto e la lacerazione sono comuni. Per un'analisi posteriore accurata, è importante ridurre al minimo questi artefatti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrino a membrana PEN (2 μm)	Lieca	1150518
Criostato di ricerca	Leica	CM3050s
Soluzione di decontaminazione RNaseZap RNasi	Fisher Scientifico	AM9780
Staccare gli stampi per incorporamento usa e getta	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 70182
Soluzione precisa	Ricerca Zymo	D3001-1
Composto Tissue-Plus O.C.T.	Fisher Scientifico	23-730-571