Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Fissazione e colorazione di sezioni di tessuto cerebrale crioconservate
- Per preservare l'integrità dell'RNA, pulire tutti gli strumenti da utilizzare con la soluzione detergente RNase. Procedere con il protocollo di fissazione e colorazione all'interno di una cappa aspirante.
- Preparare le soluzioni fissative descritte in provette da 50 mL pulite e prive di RNasi. Preparare tutte le soluzioni con acqua priva di RNasi il giorno della colorazione.
- Lo stesso giorno verrà eseguita la microdissezione laser, preparare soluzioni di etanolo al 100%, 95%, 70% e 50%. Conservare le soluzioni in provette ben chiuse a temperatura ambiente.
- Preparare il 4% di violetta cresilica e lo 0,5% di eosina Y in una soluzione di etanolo al 75%. Agitare energicamente la soluzione per 1 minuto e filtrarla attraverso un filtro di nylon da 0,45 μm per eliminare le tracce di polvere non disciolta.
- Trasferire i vetrini in un contenitore con etanolo al 95% per 30 s. Trasferire i vetrini nella provetta contenente etanolo al 75%; lasciare i vetrini per 30 s.
- Trasferire i vetrini al 50% di etanolo e lasciarli lì per 25 s. A questo punto, il PTOM sarà sciolto. Trasferire il vetrino in una soluzione di violetto di cresil al 4% per 20 s e poi trasferire in una soluzione di eosina Y allo 0,5% per 5 s.
- Estrarre il vetrino dalla soluzione colorante e asciugarlo con carta da filtro. Quindi, posizionare i vetrini in etanolo al 50% per 25 s. Trasferire i vetrini in etanolo al 75% per 25 s. Trasferire i vetrini in etanolo al 95% per 30 s. Trasferire i vetrini in etanolo al 100% per 60 s.
- Sciacquare il vetrino con xilene. Trasferitele in un contenitore con xilene e aspettate 3 minuti.
- Preparare il mezzo di montaggio (ad es. gomma Pinpoint) in acqua priva di RNasi. Per montare le sezioni del cervello del topo, diluire il mezzo di montaggio in acqua priva di RNasi in un rapporto di 1:10.
- Asciugare i vetrini su una superficie priva di RNasi a temperatura ambiente per 10 s. Prima che lo xilene si asciughi, procedere al montaggio dei vetrini con le sezioni di tessuto.
- Disperdere delicatamente la soluzione di montaggio sulla parte superiore del tessuto sul vetrino con un pennello sottile sterile e privo di RNasi. Attendere 10-20 s e quindi trasferire immediatamente i vetrini di tessuto sulla piattaforma di microdissezione del microscopio.
NOTA: Il rapporto tra il mezzo di montaggio e l'acqua priva di RNasi utilizzata per il montaggio varia a seconda del tessuto di interesse. Il rapporto mezzo di montaggio/acqua preserva la morfologia tissutale del glioma per la microdissezione laser senza compromettere l'integrità dell'RNA.
