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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione della sospensione a cellula singola dal cervello
- Diluire il terreno del gradiente di densità in rapporto 9:1 con PBS in una provetta conica da 15 mL per ottenere una soluzione finale al 100%.
- Anestetizzare i topi al picco di EAE con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico all'1% (50 mg/kg) e perfondere per via intracardica con 20 ml di PBS sterile ghiacciato. Per raggiungere questo obiettivo, iniettare lentamente e costantemente PBS nel ventricolo sinistro del cuore utilizzando una siringa da 20 ml e aprendo l'atrio destro.
- Tagliare con cura il cranio dal naso al collo, quindi rimuovere il cervello dalla scatola cranica in 10 mL di RPMI in provette coniche da 50 mL. Mescolare bene per rimuovere i globuli rossi aderenti. Quindi, rimuovere il terreno mediante aspirazione e aggiungere 10 ml di RPMI.
- Mettere le cervella e il terreno in un piatto da 100 mm. Tritare finemente con una lametta.
- Trasferire 6 ml dalla capsula a un omogeneizzatore di vetro sinterizzato ghiacciato da 7 ml con una pipetta pulita. Evitare di lasciare grandi quantità di tessuto nella pipetta. Una piccola quantità è inevitabile.
- Macinare il cervello usando prima lo stantuffo "sciolto" del pestello, quindi utilizzare lo stantuffo "stretto" fino a quando la sospensione è omogenea e versare in una provetta conica da 15 ml preraffreddata e tenere in ghiaccio.
- Dopo che tutti i campioni sono stati omogeneizzati, stimare il volume. Regolare il volume con RPMI a 7 mL. Quindi, posizionare 3 mL di matrice di membrana basale al 100% ghiacciata in una provetta da centrifuga conica da 15 mL raffreddata e aggiungere 7 mL di omogeneizzato cerebrale per ottenere un mezzo di gradiente di densità finale del 30%. Mescolare per inversione un paio di volte. Non vortice.
- Per garantire un'interfaccia nitida, aggiungere con cautela e lentamente 1 mL di terreno a gradiente di densità del sottofondo al 70% in RPMI con una pipetta da 3 mL.
- Centrifugare a 800 x g per soli 20 minuti a 4 °C. Impostare l'accelerazione su 1 e la decelerazione su 0. Dopo la centrifugazione, aspirare quasi tutta la fase superiore, facendo attenzione a rimuovere completamente la mielina nella parte superiore (Figura 1).
- Rimuovere l'interfaccia in una nuova provetta da centrifuga da 15. Regolare il volume a 10 ml con RPMI.
- Centrifugare a 500 x g per 10 min. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in ~200 μL di tampone per colorazione con citometria a flusso (FSC).
