Estrazione basata sull'immunoaffinità di peptidi ubiquitinilati: una tecnica per estrarre selettivamente peptidi marcati con ubiquitina da frazioni peptidiche purificate

Abstract

Fonte: Bezstarosti, K. et al. Rilevamento dei siti di ubiquitinazione delle proteine mediante arricchimento peptidico e spettrometria di massa. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video descrive un metodo per estrarre e purificare peptidi ubiquitinilati contenenti residui di peptidi di-glicina da una miscela di peptidi complessi. Il metodo presentato può aiutare a identificare i siti di ubiquitinazione originali nella proteina.

Protocollo

1. Estrazione di peptidi ubiquitinilati

1. Utilizzare la cromatografia C18 in fase inversa (RP) ad alto pH con materiale polimerico in fase stazionaria (300 Å, 50 μM; vedere la Tabella dei materiali) caricato in una cartuccia a colonna vuota per frazionare i peptidi triptici. La dimensione del letto di fase stazionaria deve essere adattata alla quantità di digestato proteico da frazionare. Preparare una cartuccia vuota da 6 mL (vedere la Tabella dei materiali) riempita con 0,5 g di materiale in fase stazionaria per ~10 mg di digestato proteico. Il rapporto tra digestione delle proteine e fase stazionaria dovrebbe essere di circa 1:50 (p/p).
2. Caricare i peptidi sulla colonna preparata e lavare la colonna con circa 10 volumi di colonna allo 0,1% di TFA, seguiti da circa 10 volumi di colonna di H2O.
3. Eluire i peptidi in tre frazioni con 10 volumi di colonna di soluzione di formiato di ammonio da 10 mM (pH = 10) con acetonitrile (AcN) al 7%, 13,5% e 50%, rispettivamente. Liofilizzare tutte le frazioni fino alla completezza.
4. Utilizzare anticorpi del motivo residuo di ubiquitina (K-ε-GG) coniugati a perle di agarosio di proteina A per l'immunoarricchimento dei peptidi diGly. Poiché l'esatta quantità di anticorpi per lotto di perline è un'informazione proprietaria e non divulgata dal produttore, si raccomanda di utilizzare la stessa definizione per un lotto di perline del produttore per evitare confusione. Lavare un lotto di queste perle 2 volte con PBS e dividere l'impasto delle perle in sei frazioni uguali. Vedere la Figura 1 per uno schema sperimentale dettagliato.
5. Sciogliere le tre frazioni peptidiche raccolte nella fase 1.3 in 1,4 mL di un tampone composto da 50 mM di MOPS, 10 mM di fosfato di sodio e 50 mM di NaCl (pH = 7,2) e centrifugare i detriti.
6. Aggiungere i surnatanti delle frazioni alle sfere di anticorpi diGly e incubare per 2 ore a 4 °C su un'unità rotante. Centrifugare le perle e trasferire il surnatante in un nuovo lotto di perle di anticorpi e incubare nuovamente per 2 ore a 4 °C.
7. Conservare i surnatanti per la successiva analisi del proteoma globale (GP).
8. Trasferire le perle di ogni frazione in un puntale per pipette da 200 μl dotato di un tappo filtrante GF/F per trattenere le microsfere. Inserire il puntale della pipetta con le perle in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml dotata di un adattatore per puntale da centrifuga. Lavare le perle 3 volte con 200 μL di tampone IAP ghiacciato e successivamente 3 volte con 200 μL di Milli-Q H₂O. Centrifugare la colonna a 200 x g per 2 minuti prima di ogni fase di lavaggio, ma fare attenzione a non lasciare che la colonna si asciughi. Eluire i peptidi utilizzando 2 cicli da 50 μl di TFA allo 0,15%.
9. Dissalare i peptidi utilizzando un puntale per stadi C18 (essenzialmente un puntale per pipette da 200 μl con due dischi C18) ed essiccarli fino a completarli utilizzando la centrifugazione sotto vuoto.

Risultati

Figura 1: Panoramica sperimentale.(A) Panoramica dell'approccio sperimentale. I campioni sono stati preparati, tripsinizzati e frazionati in tre frazioni utilizzando la cromatografia in fase inversa con eluizione ad alto pH. Un lotto di perle di anticorpi peptidici commerciali α-diGly è stato diviso in sei frazioni uguali e le tre frazioni peptidiche sono state quindi caricate su tre delle frazioni di perline. I peptidi diGly sono stati...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lisil endopeptidasi (LysC)	Wako Pure Chemicals	Codice 129-02541
Forno NanoLC	MPI design, MS Wil GmbH
N-lauroilsarcosina sale sodico	Sigma-Aldrich	L-5125
Orbitrap Fusion Lumos mass spettrometro	ThermoFisher
PLRP-S (300 Å, 50 μm) polimerico particelle di fase inversa	Tecnologie Agilent	PL1412-2K01
PTMScan Ubiquitina Residuo Motif (K-ε-GG) Corredo	Tecnologie di segnalazione cellulare	Codice: 5562
Cartuccia Sep-Pak tC18 6 cc Vac	Acque	WAT036790	Rimuovere il materiale tC18 dal cartuccia prima di riempire la cartuccia con PLRP-S
Desossicolato di sodio	Sigma-Aldrich	Telefono 30970
Tris-base	Sigma-Aldrich	Codice: T6066
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Tripsina, trattata con TPCK	ThermoFisher	Anno 20233