Saggio Di Sintesi Del Dna: Una Tecnica Per Valutare La Sintesi Del DNA Nelle Cellule Proliferanti Utilizzando L'Incorporazione Radioattiva Di Timidina Triziata

Abstract

Fonte: Williams, M. et al. Rilevamento rapido dei fenotipi dello sviluppo neurologico nelle cellule precursori neurali umane (NPC). J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, determiniamo la capacità proliferativa delle cellule progenitrici neuronali misurando l'incorporazione della timidina triziata tracciante radioattiva nel DNA delle cellule. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare la proliferazione cellulare dopo il trattamento con determinati farmaci e fattori di crescita.

Protocollo

1. Manutenzione degli NPC

1. Piastra di NPC a una densità di 1,5 milioni di cellule in un pozzetto rivestito di gel che imita la ECM contenente 2 mL di terreno di espansione al 100%.
2. Incubare le NPC a 37 °C in un ambiente umido con il 5% di CO₂.
3. Aggiungere 5 μM di inibitore ROCK al terreno per NPC a P3 o inferiore, o per NPC scongelate, per prevenire un'eccessiva morte cellulare. Sostituire il terreno dopo 24 ore per rimuovere l'inibitore ROCK.
4. Celle di passaggio ogni 4-9 giorni, a seconda di quando diventano confluenti. Le cellule sono considerate confluenti quando diventano un monostrato densamente impacchettato che copre l'intero fondo della superficie del piatto.
5. Piastra NPC a una densità compresa tra 1 e 1,5 milioni di celle per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Rimuovere il terreno esaurito ogni 48 ore e sostituirlo con 2 ml di terreno di espansione al 100%.

3. Saggio di sintesi del DNA delle cellule precursori neurali

1. Piastra 100.000 cellule/pozzetto in una piastra a 24 pozzetti e valutazione in triplice copia/condizione.
2. Aggiungere [³H]-timidina radioattiva e triziata al terreno di coltura (1,5 μCi/mL) in ciascun pozzetto dopo 46 ore di coltura. Incubare le cellule a 37 °C per 2 h.
   nota: Quando si utilizzano materiali radioattivi, ricevere una formazione dal proprio istituto, seguire i protocolli di sicurezza contro la radioattività e smaltire i materiali radioattivi negli appositi contenitori per i rifiuti.
3. Rimuovere e smaltire correttamente i mezzi radioattivi dopo 2 ore. Aggiungere 300 μl di tripsina-EDTA allo 0,25% preriscaldato (0,5 mM) in ciascun pozzetto e incubare per 20 minuti a 37 °C.
4. Accendere la mietitrice di celle (vedere la sezione Materiali) e la pompa e assicurarsi che la pressione della pompa sia inferiore a 200 PSI. Posizionare la carta da filtro attraverso lo spazio nella raccoglitrice di cellule e strappare l'angolo destro per contrassegnare l'orientamento della carta.
5. Posizionare i tubi di raccolta della raccoglitrice di cellule in un vassoio vuoto "vuoto" e premere il prelavaggio per inumidire la carta da filtro. Posizionare le provette di raccolta nei pozzetti del campione ed eseguire l'operazione (avvio).
6. Quando il raccoglitore di cellule ha terminato la raccolta dei campioni, sollevare il morsetto e far avanzare la carta da filtro per ripetere l'operazione per tutti i set di campioni. Prelavare sempre in una piastra vuota e "vuota".
7. Asciugare la carta da filtro sotto una fonte di luce e posizionare le fiale corrispondenti in un vassoio. Perforare i pezzi di carta nelle fiale e aggiungere 2 ml di cocktail di scintillazione liquida a ciascuna fiala. Tappo ed etichettare le fiale.
8. Incubare i flaconcini in un cocktail di scintillazione liquida per almeno 1 ora prima di leggere i conteggi al minuto (CPM) su una macchina a scintillazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM/F12 avanzato medio	ThermoFischer Scientific	Codice 12634-010	Componente del mezzo di espansione al 100%
Terreno neurobasale	ThermoFischer Scientific	21103049
Piastre a 24 pozzetti	ThermoFischer Scientific	Anno 2021-05	Piastre in polistirene: utilizzate per il saggio di sintesi del DNA NPC
Laminina di topo naturale	Invitrogen	Codice 23017-015	Substrato per il rivestimento di piastre: utilizzato per la sintesi di DNA NPC, l'ingresso in fase S e i saggi del numero di cellule
Penicillina/Streptomicina	ThermoFischer Scientific	15140122	Antibiotico, componente nei terreni di espansione
2,5% Tripsina (10X)	Gibco	Codice 15090-046	Soluzione enzimatica 10X
0,5 M EDTA	ThermoFischer Scientific	AM9261	Utilizzato in soluzione di tripsina per il sollevamento di cellule per il saggio di sintesi del DNA
[3H]-timidina triziata	PerkinElmer	NET027E001	Trizio radioattivo, timidina
Fisherbrand Fiale a scintillazione in HDPE da 7 mL	Fisherbrand	03-337-1	Flaconi per conteggio a scintillazione liquida
EcoLite(+)	MP Biomedicali	188247501	Cocktail di scintillazione liquida
LS 6500 Contatore a scintillazione liquida multiuso	Beckman Coulter	8043-30-1194	Contatore a scintillazione liquida
Skatron Raccoglitore di cellule semi-automattiche	Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc.	Tipo 11019	Raccoglitrice di celle semiautomatica
Carta da filtro GF/C di qualità, Whatman	GE Healthcare Scienze della vita	Anno 1822-849	Carta da filtro in fibra di vetro