Saggio della neurosfera NPC: un test in vitro per valutare la risposta migratoria delle cellule precursori neurali della neurosfera

Abstract

Fonte: Williams, M. et al. Rilevamento rapido dei fenotipi dello sviluppo neurologico nelle cellule precursori neurali umane (NPC).J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra il saggio di migrazione della neurosfera delle cellule precursori neurali, un test in vitro per studiare la risposta migratoria delle cellule precursori neurali della neurosfera, tramite analisi microscopica.

Protocollo

1. Saggio di migrazione della neurosfera NPC

1. Formazione della neurosfera
   1. Aggiungere 1 mL di Terreno di Dilatazione al 100% in una piastra da 35 mm senza substrato di rivestimento. Incubare le piastre per almeno 15 minuti a 37 °C prima di impiattare le NPC. Preparare 2-3 piastre per assicurarsi che ci siano abbastanza neurosfere per il saggio di migrazione cellulare.
      nota: L'assenza di un substrato di rivestimento assicura che le NPC rimangano sospese nel mezzo, il che è essenziale per la formazione della neurosfera. Il rivestimento dei piatti previene la formazione di neurosfere.
   2. Celle di sollevamento, dissociazione e pellet. Risospendere il pellet cellulare in 2-5 mL di terreno di espansione preriscaldato al 100%. Placca 1 milione di NPC in ogni piatto da 35 mm preparato nella sezione 1.1.1.
   3. Incubare le NPC a 37 °C per 48-96 ore per consentire alle NPC di aggregarsi e formare neurosfere. Valutare le dimensioni della sfera utilizzando un righello vivo su un microscopio a contrasto di fase. Attendere che la maggior parte delle sfere raggiunga un diametro approssimativo di 100 μm (± 20 μm) (Figura 1). Le sfere più piccole si disperderanno completamente e si romperanno durante il saggio di migrazione.
2. Preparazione delle piastre per il saggio di migrazione della neurosfera
   1. Sciogliere le aliquote di gel che imitano l'ECM in 6 mL di terreno di espansione al 30%. Una volta preparata la soluzione di gel mecmico ECM/terreno di espansione al 30%, aggiungere veicoli, fattori di crescita o farmaci di interesse alle concentrazioni desiderate.
      nota: Le concentrazioni di veicoli, farmaci e fattori di crescita devono essere aumentate per tenere conto dell'aggiunta di 200 μL di neurosfere nella sezione 1.3.
   2. Piastra 1 mL di gel ECM-mimic/soluzione di terreno di espansione al 30% (± veicoli, fattori di crescita o farmaci) in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Realizzare 2-3 pozzetti per condizione sperimentale. In alternativa, è possibile utilizzare piatti da 35 mm. Incubare le piastre per almeno 30 minuti a 37 °C^.
      nota: NON aspirare la soluzione di gel che imita l'ECM/terreno di espansione al 30% per questo test. La placcatura delle sfere su un gel ECM-Mimic aspirato porterà a una migrazione rapida ed eccessiva.
3. Neurosfere di placcatura
   1. Raccogliere le neurosfere formate nella sezione 1.1 e posizionarle in un tubo conico. Lavare le piastre da 35 mm con 1 ml di 1x PBS per assicurarsi che tutte le neurosfere siano raccolte. Far girare le neurosfere raccolte a 100 x g per 5 min.
   2. Risospendere le neurosfere in 1-3 mL di terreno di espansione al 30% preriscaldato. Se viene raccolto 1 piatto di neurosfere, viene utilizzato 1 ml di terreno per risospendere le sfere. Se vengono raccolti 2 piatti, vengono aggiunti 2 ml di terreno per risospendere le sfere, ecc. Pipettare delicatamente e utilizzare solo un P-1000 per assicurarsi che le sfere non vengano rotte.
   3. Piastra 200 μl delle neurosfere risospese nel gel mimico ECM/soluzione di espansione al 30% realizzata nella sezione 1.2. Placche rocciose in tutte le direzioni per distribuire uniformemente le neurosfere. Incubare le piastre per 48 ore a 37°C.
   4. Rimuovere la soluzione di gel chemico ECM/terreno di espansione al 30% e fissare le cellule in PFA al 4%, lavare e mantenere le cellule in 1x PBS + 0,05% di sodio azide.
4. Analisi delle neurosfere
   1. Acquisisci immagini di intere neurosfere utilizzando le impostazioni di contrasto di fase a 10X. Assicurati che le sfere non si tocchino l'una con l'altra. Misura la migrazione media utilizzando il software ImageJ.
   2. Traccia il contorno esterno della neurosfera usando lo strumento della linea a mano libera. È possibile accedere alla linea a mano libera facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'icona della linea "retta". Traccia manualmente utilizzando un mouse.
   3. Utilizzare la funzione di misurazione per calcolare l'area della traccia. Assicurarsi che "area" sia selezionata come lettura nella finestra "Imposta misure" che si trova nella scheda Analizza. Vedere la Figura 2 per la traccia del contorno esterno in blu.
   4. Traccia la massa cellulare interna della sfera e misura l'area. Vedere la Figura 2 per la traccia del contorno interno in rosso. Quantificare la migrazione media sottraendo la massa cellulare interna dall'area totale della neurosfera.
   5. Misurare le neurosfere che presentano una massa cellulare interna densamente compatta con cellule che migrano verso l'esterno come un tappeto contiguo (Figura 2).
   6. Non includere cellule al di fuori del tappeto o staccate dalla neurosfera per la misurazione. Vedere la Figura 2 per esempi di celle (cerchiate in bianco) che sono escluse dalla misurazione del tappeto esterno. Analizza un minimo di 20 neurosfere per ogni condizione.

Risultati

Figura 1: Selezione delle neurosfere per il saggio di migrazione. (A) Immagine a contrasto di fase di un campo rappresentativo di neurosfere a 24 ore. Le sfere sono tutte inferiori a 100 μm e quindi non vengono raccolte per il saggio di migrazione. (B) Immagine a contrasto di fase di un campo rappresentativo di neurosfere a 72 ore. Tutte le sfere sono comprese tra 100 μm ± 20 μm, il che indica che sono ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Terreno neurobasale	ThermoFischer Scientific	21103049	Componente sia del NIM che del mezzo di espansione al 100%
PSC Neural Induction Medium: Protocollo Link: https://goo.gl/ euub7a	ThermoFischer Scientific	A1647801	Si tratta di un kit composto da un terreno neurobasale (NB) e da un integratore di induzione neurale (NIS) 50x. Il NIS viene utilizzato per produrre un mezzo di induzione neurale 1X e un mezzo di espansione al 100%
DMEM/F12 avanzato medio	ThermoFischer Scientific	Codice 12634-010	Componente del mezzo di espansione al 100%
Matrigel qualificato hESC	Corning	354277	Gel mimico per matrice extracellulare qualificato hESC (gel mimico ECM)
Piastre a 6 pozzetti	Corning	COR-3506	Piastre in polistirene utilizzate per la manutenzione degli NPC e per il saggio di migrazione delle neurosfere
Umano di base FGF-2	Peprotech	100-18B	Fattore di crescita
Penicillina/Streptomicina	ThermoFischer Scientific	15140122	Antibiotico, componente di NIM, terreno di espansione al 100% e terreno di espansione al 30%