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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento e placcatura di cellule corticali miste
L'isolamento di cellule corticali miste per colture di astrociti può essere eseguito utilizzando cuccioli di topo da P1 a P4. Per ottenere una corretta densità di astrociti è necessario utilizzare 4 cortecce di cuccioli di topo per pallone di coltura tissutale T75. Pertanto, i volumi nel seguente protocollo vengono calcolati per una preparazione cellulare utilizzando 4 cuccioli di topo.
- Prima di iniziare la procedura di dissezione, preriscaldare 30 mL di terreno di coltura per astrociti (DMEM, glucosio alto + 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente + 1% di penicillina/streptomicina; vedere tabella) a 37 °C. Rivestire un pallone T75 con 20 mL di poli-D-lisina (PDL) a una concentrazione di 50 μg/mL in acqua per colture cellulari per 1 ora a 37 °C nell'incubatore di CO2.
- Per la procedura di dissezione, preparare tutti i reagenti e i materiali necessari. Avrai bisogno di forbici chirurgiche, pinze fini lisce, pinze a punta piatta, tovaglioli di carta, un sacchetto per i rifiuti, etanolo al 70% e 2 piastre da dissezione (3,5 cm di diametro) su ghiaccio riempite con 2 ml di HBSS ciascuna.
- Tenere delicatamente e spruzzare la testa e il collo del cucciolo di topo con etanolo al 70%. L'animale viene sacrificato per decapitazione con le forbici.
- Eseguire un'incisione sulla linea mediana, da posteriore a anteriore, lungo il cuoio capelluto per rivelare il cranio.
- Taglia con cura il cranio dal collo al naso. Vengono eseguiti due tagli aggiuntivi per consentire un ulteriore accesso al cervello: il primo taglio viene effettuato anteriormente ai bulbi olfattivi, l'altro inferiormente al cervelletto per scollegare il cranio dalla base del cranio.
- Utilizzando la pinza a punta piatta, i lembi cranici vengono delicatamente girati di lato e il cervello viene estratto e inserito nel primo piatto di dissezione riempito con HBSS. Rimetti il piatto sul ghiaccio e continua a raccogliere tutti e 4 i cervelli.
- Il resto della procedura di dissezione viene eseguito sotto uno stereomicroscopio. In primo luogo, i bulbi olfattivi e il cervelletto vengono rimossi utilizzando la pinza da dissezione fine (Figura 1B).
- Per recuperare le cortecce, afferrare l'estremità posteriore del cervello con la pinza, eseguire un'incisione sulla linea mediana tra gli emisferi, inserire una seconda serie di pinze nel boschetto creato e staccare la struttura a placche della corteccia dal cervello.
- Sezionare con cura le meningi dagli emisferi della corteccia tirando con la pinza fine (Figura 1D'). Questo passaggio evita la contaminazione della coltura finale degli astrociti da parte di cellule meningee e fibroblasti. Trasferisci gli emisferi della corteccia preparati nel secondo piatto riempito di HBSS e rimettilo sul ghiaccio. Continuate di conseguenza con tutte e 4 le cortecce.
- Infine, taglia ogni emisfero della corteccia in piccoli pezzi usando lame affilate (circa 4-8 volte).
- In condizioni sterili, trasferire i pezzi di corteccia in una provetta Falcon da 50 mL e aggiungere HBSS per un volume totale di 22,5 mL.
- Aggiungere 2,5 mL di tripsina al 2,5%, mescolare e incubare il fazzoletto nel bagno d'acqua a 37 °C per 30 min. Mescolare agitando di tanto in tanto ogni 10 min.
- Centrifugare per 5 minuti a 300 x g per pellettare pezzi di tessuto cortex
.
- Rimuovere con cura il surnatante per decantazione. Per evitare di perdere il pellet di tessuto, è possibile trattenerlo meccanicamente utilizzando una pipetta. Dissociare il tessuto in una sospensione di una singola cellula aggiungendo 10 mL di terreno di placcatura per astrociti e pipettando energicamente con una pipetta di plastica da 10 mL fino a quando i pezzi di tessuto non si dissociano in singole cellule (da 20 a 30 volte). Regolare il volume a 20 mL utilizzando il terreno di placcatura per astrociti. È possibile dimostrare la dissociazione del tessuto della corteccia in singole cellule contando con un ematocitometro. Una preparazione di 4 cortecce di cuccioli di topo dovrebbe produrre 10-15 x106 singole cellule dissociate.
- Aspirare il PDL dal pallone di coltura T75, impiattare la sospensione monocellulare dissociata e incubare a 37 °C nell'incubatore di CO2.
2. Ottenere una coltura di astrociti arricchita
- Cambiare il terreno 2 giorni dopo la piastratura delle cellule corticali miste e tutti i 3 giorni successivi.
- Dopo 7-8 giorni, quando gli astrociti sono confluenti e le microglia sovrapposte sono esposte sullo strato degli astrociti o sono già staccate dallo strato degli astrociti (Figura 2), agitare il pallone T75 a 180 giri/min per 30 minuti su un agitatore orbitale per rimuovere la microglia. Scartare il surnatante contenente microglia o, se si desidera coltivare ed esaminare la microglia, centrifugarlo e impiattarlo per la coltura.
- Aggiungere 20 mL di terreno di coltura di astrociti freschi e continuare agitando il pallone a 240 giri/min per 6 ore per rimuovere le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Poiché alcuni OPC non si staccano completamente dallo strato di astrociti, continuare a agitare energicamente con le mani per 1 minuto per prevenire la contaminazione da OPC. Scartare il surnatante o girarlo e impiattare, se si desidera coltivare OPC.
- Sciacquare due volte lo strato confluente rimanente di astrociti con PBS, aspirare il PBS, aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA e incubare nell'incubatore di CO2 a 37 °C. Controllare il distacco degli astrociti ogni 5 minuti e forzare il distacco degli astrociti colpendo il pallone contro il palmo della mano (2-3 volte).
- Dopo aver staccato gli astrociti dal pallone di coltura, aggiungere 5 mL di terreno di coltura per astrociti, centrifugare le cellule a 180 x g per 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 40 mL di terreno di placcatura per astrociti freschi. Un pallone di coltura tissutale T75 dovrebbe produrre circa 1x106 cellule dopo la prima divisione cellulare. Piastre le cellule in due fiasche di coltura T75 e incubate a 37 °C nell'incubatore di CO2. Cambia il mezzo ogni 2 o 3 giorni.
- 12-14 giorni dopo la prima divisione, gli astrociti vengono piastrati nella concentrazione cellulare appropriata, 24-48 ore prima di eseguire l'esperimento. Un pallone di coltura tissutale T75 dovrebbe produrre circa 1,5-2 x106 cellule dopo la seconda divisione cellulare.
