Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento dei microvasi cerebrali di ratto
- Per ogni preparazione e per uno sperimentatore, utilizzare 3 ratti Wistar di cinque settimane.
- Lunedì della prima settimana, preparare 2 fiasche T75 rivestendole con collagene di tipo IV e fibronectina, entrambe a 1 μg/cm2 in acqua di coltura sterile (10 ml per T75). Lasciare aderire a 37 °C fino alla semina dei microvasi.
- Mercoledì mattina della prima settimana, sopprimere i ratti sotto un flusso crescente di CO2 per indurre sonnolenza, perdita di postura e interruzione della respirazione, seguita da lussazione cervicale. Spruzzare le testine con etanolo al 70%. Tagliate le teste con un paio di forbici e trasferitele in una capsula di Petri asciutta sotto una cappa a flusso laminare.
- Rimuovere i cervelli dal cranio senza il cervelletto e i nervi ottici, quindi trasferirli in una capsula di Petri raffreddata su ghiaccio e riempita con tampone di dissezione fredda (HBSS integrato con BSA all'1%, penicillina 100 unità/ml e streptomicina 100 μg/ml).
- Tagliare il cervello a metà per separare i 2 emisferi cerebrali e separare il mesencefalo dal proencefalo. Trasferire i proencefali in una capsula di Petri pulita su ghiaccio con tampone di dissezione.
- Prelevare un paio di emisferi in una nuova capsula di Petri con tampone di dissezione a freddo per rimuovere accuratamente le meningi dal proencefalo sotto uno stereomicroscopio con N° 5 pinze curve. Quindi, pulisci l'interno del cervello per rimuovere il piumone di mielina e ottenere un guscio di corteccia. Questi passaggi non dovrebbero richiedere più di 2 ore per la conservazione dei tessuti e la sopravvivenza cellulare.
- Dissociare la corteccia da 3 cervelli in 6 mL di tampone di dissezione fredda in un omogeneizzatore dounce da 7 mL con 10 colpi su e giù con ciascuno dei 2 pestelli di diverse clearance, 71 μm seguiti da 20 μm.
- Dividere la sospensione per ottenere l'equivalente di 1 corteccia in 1 mL di una provetta Falcon da 50 mL e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante.
- Digerire la sospensione da 1 corteccia con 1 mL di una soluzione enzimatica contenente una miscela di collagenasi/dispasi (60 μg/mL–0,3 U/mL), DNasi di tipo I (35 μg/mL–20 K unità/mL) e gentamicina (50 μg/mL) in un agitatore per 30 minuti a 37 °C.
- Miscelare 1 mL di digestato da 1 corteccia con 10 mL di 25 % BSA/HBSS 1X e separare mediante centrifugazione densità-dipendente a 3.600 x g per 15 minuti a RT. Trasferire con cautela il disco superiore (mielina e parenchima cerebrale) e il surnatante in una provetta Falcon da 50 mL pulita e ripetere la centrifugazione. Mantenere il pellet risultante contenente i microvasi cerebrali a 4 °C.
- Eliminare con cura il disco superiore e il surnatante. Risospendere entrambi i pellet risultanti contenenti i microvasi cerebrali con 1 mL di HBSS 1X freddo e trasferirli in una provetta Falcon da 50 mL pulita.
- Lavare i microrecipienti con l'aggiunta di 20 mL di HBSS 1X freddo e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante.
- Inoltre, digerire i microvasi da 1 corteccia con 1 mL della stessa soluzione enzimatica come descritto al punto 1.9 durante 1 ora a 37 °C in uno shaker.
- Quindi, mescolare i microvasi digeriti da ciascuna delle 3 cortecce in una provetta e separarli ulteriormente in due provette Falcon da 50 ml per ottenere microvasi estratti dall'equivalente di una corteccia e mezza (1,5) per provetta. Aggiungere 30 mL di tampone di dissezione a freddo e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a RT.
- Risospendere il pellet di microvasi in 10 mL di DMEM/F12 integrato con il 20% di siero plasmaderivato povero di piastrine bovine, fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF, 2 ng/mL), eparina (100 μg/mL), gentamicina (50 μg/mL) e HEPES (2,5 mM), denominati mezzi cellulari endoteliali (ECM) integrati con puromicina a 4 μg/mL.
- Prendere i 2 palloni T75 rivestiti dall'incubatrice, aspirare l'eccesso di rivestimento e placcare i microrecipienti da ciascun tubo in un pallone T75 (microrecipienti estratti da 1,5 corteccia per pallone T75).
