Barriera tumorale emato-encefalica o modello BBTB: un adattamento del modello di barriera emato-encefalica o BBB per valutare la somministrazione di terapie al tumore

Abstract

Fonte: Le Joncour, V. et al. Previsione della consegna di carichi utili in vivo utilizzando una barriera tumorale emato-encefalica in un piatto. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, descriviamo un protocollo completo per stabilire un modello in vitro che imita la barriera tumorale emato-encefalica. Il modello è promettente per comprendere la somministrazione di agenti terapeutici per il trattamento dei tumori cerebrali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Istituzione dei BBTB Mimics

NOTA: Il terreno di coltura cellulare e gli integratori sono dettagliati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione degli Astrociti
   nota: I seguenti volumi sono adatti per una piastra di Petri da 10 cm o un pallone per colture cellulari T75.
   1. Sotto una cappa sterile per colture cellulari, lavare accuratamente gli astrociti in coltura con 5 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Eliminare delicatamente il PBS utilizzando una pompa a vuoto e aggiungere 2 mL di reagente di dissociazione cellulare per 5 minuti (a 37 °C, vedere la Tabella dei materiali) per staccare le cellule. Controllare il distacco delle cellule al microscopio. Non superare i 5 minuti di incubazione per limitare lo stress sulle cellule.
   2. Aggiungere 10 mL di terreno sterile completo per colture cellulari di astrociti (ABM+) al recipiente per inibire l'attività del reagente di dissociazione cellulare. Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire le cellule staccate dal recipiente in una provetta sterile da 15 mL. Centrifugare la sospensione della cella per 3 minuti a 250 rcf (accelerazione: 9 rcf/s, decelerazione: 5 rcf/s) a temperatura ambiente (RT).
   3. Nel frattempo, preparare gli inserti (vedere la Tabella dei materiali): Utilizzando una pinza sterile, posizionare gli inserti con il cervello rivolto verso l'alto (Figura 1A) sul coperchio di una piastra sterile a 6 pozzetti (Figura 1B). Verificare preventivamente che la piastra possa essere posizionata capovolta sugli inserti senza toccare o spostare gli inserti durante il processo.
      NOTA: Il corretto posizionamento degli inserti consente l'intrappolamento della sospensione degli astrociti tra la membrana e il fondo del pozzetto.
   4. Una volta centrifugato, scartare con cura il surnatante dalla sospensione cellulare; risospendere il pellet di astrociti in 1 mL di ABM+ risospendendo delicatamente il pellet sulla parete della provetta fino a 5 volte. Evitare un pipettaggio eccessivo delle cellule per limitare lo stress sulle cellule. Contare le cellule e regolare la densità della sospensione cellulare a 1,5 x 10⁵ celle in 400 μL di ABM+/inserto.
   5. Posizionare la sospensione cellulare al centro del lato cerebrale della membrana dell'inserto (Figura 1B) e, con molta attenzione, stenderla usando la forza capillare con una punta di pipetta sterile. Evitare il contatto diretto in quanto la membrana è particolarmente fragile.
   6. Con il lato cervello degli inserti ancora rivolto verso l'alto, riposizionare la piastra a 6 pozzetti sugli inserti. Ciò garantisce che la sospensione cellulare sia intrappolata tra la membrana e il fondo effettivo del pozzetto (Figura 1C). Evitare la formazione di bolle d'aria nella sospensione cellulare, in quanto impedirà la diffusione omogenea degli astrociti sulla membrana.
   7. Posizionare la piastra e gli inserti, con il cervello rivolto verso l'alto, nell'incubatore (a 37 °C con 5% di CO₂) per consentire l'adesione della cellula per un minimo di 2 ore (astrociti murini immortalizzati) e fino a 6 ore (astrociti primari umani).
      NOTA: Poiché gli inserti vengono mantenuti capovolti, la visualizzazione dell'adesione cellulare non è possibile al microscopio. Si raccomanda quindi di seminare un recipiente di coltura cellulare regolare separato e di controllare l'adesione cellulare nel vaso nel tempo. Un'attenta manipolazione della membrana è d'obbligo, poiché i risultati saranno inaffidabili quando le membrane sono danneggiate.
   8. Al termine del tempo di incubazione, verificare l'assenza di perdite di sospensione cellulare al di fuori dell'area di semina e scartare gli inserti se sono permeabili. Riportare la piastra a 6 pozzetti nella sua posizione normale, con gli inserti che ora avranno il lato del sangue rivolto verso l'alto (Figura 1A). Aggiungere 2,6 mL di ABM+ a ciascun pozzetto. Versare 2,5 mL di terreno astrocitario completo in ciascun inserto e posizionare la piastra nell'incubatore (a 37 °C con il 5% di CO₂).

2. Preparazione delle cellule endoteliali

NOTA: Per le cellule endoteliali microvascolari cerebrali murine (bEND3), le cellule devono raggiungere il 100% di confluenza per garantire il massimo contatto cellula-cellula innescando l'espressione ottimale della proteina a giunzione stretta il giorno dell'esperimento. Questo non si applica alle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HuAR2T) poiché la presenza di astrociti è necessaria per un'espressione proteica a giunzione stretta per queste cellule.

1. Procedere come descritto in precedenza per gli astrociti per la dissociazione cellulare. Una volta centrifugato, scartare con cura il surnatante; risospendere il pellet di cellule endoteliali in 1 mL di terreno di coltura cellulare endoteliale completo (EBM+) pipettando lentamente la sospensione cellulare sulla parete del tubo fino a 5x. Evitare un pipettaggio eccessivo delle cellule per limitare lo stress sulle cellule. Contare le cellule e regolare la densità della sospensione cellulare a 2 x 10⁵ cellule in 2,5 mL/inserto di terreno di coltura cellulare endoteliale privo di siero (EBM-) e fattore di crescita endoteliale vascolare-A (VEGF-A).
2. Estrarre la piastra contenente gli inserti, scartare con cura il terreno dal lato del sangue e sostituirlo con 2,5 mL di sospensione di cellule endoteliali. Rimettere la piastra nell'incubatore (a 37 °C con il 5% di CO₂) e lasciarla per una notte affinché le cellule endoteliali aderiscano alla membrana.
3. Il giorno successivo, preparare una piastra sterile a 6 pozzetti trasferendo 3 mL di terreno per astrociti preriscaldato privo di siero (ABM-) in ciascun pozzetto. Maneggiando gli inserti con una pinza sterile, scartare con cura il terreno completo endoteliale dal lato del sangue, posizionare l'inserto nella nuova piastra contenente ABM- e aggiungere 2,5 mL di EBM-.
   nota: L'uso dell'EBM- è fondamentale per la creazione della barriera endoteliale.
4. Lasciare gli inserti nell'incubatore (a 37 °C con il 5% di CO₂) con disturbi fisici e variazioni di temperatura minimi per 5 giorni, consentendo la produzione della membrana basale endoteliale, i contatti degli astrociti con le cellule endoteliali e, infine, la formazione mimica della BBTB. Sostituire il terreno il giorno del trasferimento su colture cellulari di glioma.

3. Preparazione delle cellule di glioma

NOTA: Sebbene qui vengano utilizzate sfere di glioblastoma derivate da pazienti, il seguente protocollo può essere facilmente adattato per cellule di glioblastoma aderenti e disponibili in commercio come U-87MG.

1. Facoltativamente, per l'imaging a immunofluorescenza, posizionare fino a quattro vetrini coprioggetti rotondi sterili in borosilicato (ø 0,9 cm) per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti contenente 2 mL di poli-D-lisina (0,01%). Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
2. Nel frattempo, trasferire con cura le sfere tumorali dal recipiente di coltura cellulare a una provetta sterile da 15 ml utilizzando una pipetta sierologica sterile. Centrifugare le sfere tumorali per 3 minuti a 250 rcf.
3. Scartare il surnatante, risospendere delicatamente le sfere in 1 mL di terreno cellulare di glioma privo di bFGF/EGF (GBM-) e contare le cellule. Regolare la densità cellulare a circa 10-4 sfere/mL (10-5 cellule/mL) in GBM-.
4. Scartare la poli-D-lisina dai pozzetti e sciacquarli 3 volte con PBS sterile. Seminare la piastra con 3 mL/pozzetto della sospensione sferoidale tumorale e trasferire gli inserti con il BBB mimic sulla sospensione delle cellule tumorali.
5. Incubare per una notte (a 37 °C con il 5% di CO₂) per consentire l'equilibrio tra il sangue e i lati del tumore cerebrale del test. Il giorno successivo, sostituire il terreno nel lato del sangue con EBM- integrato con le molecole/farmaci/nanoparticelle di interesse. I campioni vengono raccolti nel tempo per la quantificazione diretta, come descritto nella sezione precedente. Le cellule sono fissate in un punto temporale preciso per l'imaging a fluorescenza.

Risultati

Figura 1: Descrizione del modello di barriera emato-encefalica (BBTB).(A) Rappresentazione schematica delle posizioni dei diversi tipi di cellule. (B) Illustrazione del posizionamento dell'inserto sul coperchio della piastra a 6 pozzetti e della tecnica di semina per gli astrociti sul lato cerebrale della membrana dell'inserto. (C) Illustrazione del posizionamento della piastra a 6 pozz...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
cellule
bEND3	ATCC	Codice CRL-2299	Coltivato in: DMEM (1 g/L di glucosio) integrato con il 10% di FBS- 5 mL di L-glutammina e 5 mL di penicillina/streptomicina
HIFko ha immortalato gli astrociti di topo	Isolato nel laboratorio della dottoressa Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Coltivato in: BME-1 integrato con il 5% di FBS- 5 mL, 1 M HEPES-5 mL, 100 mM di piruvato di sodio- 3 g di D-glucosio e 5 mL di penicillina/streptomicina
HuAR2T	Isolato nel laboratorio della dottoressa Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184	Coltivato in: EBM-2 con SupplementMix normali astrociti primari umani Lonza CC-2565 Coltivato in: ABM con SingleQuots
Materiale e reagenti
100 mm x17 mm Piatto Nunclon Delta	ThermoFisher Scientifico	Codice 150350
10 mL di pipetta sierologica	ThermoFisher Scientifico	170361
Provette da centrifuga sterili coniche in polipropilene da 15 mL	ThermoFisher Scientifico	Codice 339650
ABM Basale Medium 500 mL	Lonza	CC-3187	Per astrociti umani primari. ABM+: contiene tutti gli additivi della miscela di integratori. ABM-: tutti gli additivi ad eccezione di rhEGF e FBS
Soluzione per il distacco di cellule Accutase	Corning	25-058-CI
AGM SingleQuots Integratori e fattori di crescita	Lonza	CC-4123
Supplemento B27	Gibco	Codice 17504-044	Sia per GBM + che per - medium
Aquila media basale	ThermoFisher Scientifico	21010046	BME-1
Piastre a 6 pozzetti trattate con TC Corning Costar	Sigma-Aldrich	CLS3506
Inserti per colture cellulari con membrana in poliestere Corning Transwell	Sigma-Aldrich	CLS3452
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	Sciogliere in 50 mL di BME-1 e filtro sterile prima di aggiungere al terreno
Prosciutto F-12 Medium/Nutrient Modified Eagle's di Dulbecco	Gibco	Codice 21331-020	Specifico per la coltura delle sfere derivate dal paziente isolate nel nostro laboratorio; può variare per altre linee cellulari di glioma
EBM-2 crescita Medium SupplementMix	PromoCell	C-39216	EBM+: contiene tutti gli additivi della miscela di integratori. EBM-: tutti gli additivi ad eccezione di VEGF-A e FBS
Terreno basale endoteliale 2 (EBM-2)	PromoCell	C-22211	EBM+: contiene tutti gli additivi della miscela di integratori. EBM-: tutti gli additivi ad eccezione di VEGF-A e FBS
Siero fetale bovino (FBS), qualificato, inattivato termicamente, approvato dall'UE Origine sudamericana	ThermoFisher Scientifico	10500056
Sale sodico di fluoresceina	Sigma-Aldrich	Codice: F6377
Greiner CELLSTAR Piastre a 96 pozzetti	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Pozzetti in polistirene nero a fondo piatto (con fondo microtrasparente)
Menzel-GlÄser 0,9 cm rotondo borosilicato Vetrini di copertura	Termo Scientifico	10313573
Compresse PBS	Medicago	09-9400-100	Una compressa per litro di dH2O; quindi sterilizzare la soluzione in autoclave
Bromidrato di poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407
EGF umano ricombinante	Peprotech	GMP100-15	Per GBM+ medio
FGF-basico umano ricombinante (154 a.a.)	Peprotech	100-18B	Per GBM+ medio