Saggio di permeabilità mimica della barriera emato-encefalica: un test in vitro per valutare la permeabilità della BBB che imita le molecole traccianti

Abstract

Fonte: Le Joncour, V. et al. Previsione della consegna di carichi utili in vivo utilizzando una barriera emato-encefalica in un piatto. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video descrive un test di permeabilità per valutare la permeabilità della barriera emato-encefalica in vitro utilizzando molecole di fluoresceina di sodio.

Protocollo

1. Misurazione della permeabilità mimica BBTB
   

   1. La diffusione passiva del colorante fluorescente a basso peso molecolare sodio-fluoresceina (Na-Fl) nel tempo dal sangue al lato cerebrale degli inserti consente il calcolo dei valori di permeabilità secondo la seguente formula:
      Qui, dFwell è il valore di fluorescenza misurato nel pozzetto in un determinato punto temporale meno il valore di autofluorescenza del terreno di coltura cellulare, dT è il tempo in secondi, A è la superficie della barriera in centimetri quadrati e dFinsert è il valore di fluorescenza misurato nell'inserto nello stesso punto temporale meno il valore di autofluorescenza del mezzo).
   2. Raccogliere 100 μl di terreno sia dal sangue che dal lato cerebrale del BBTB mimic e trasferire ciascuno di essi in una piastra nera a 96 pozzetti separata a fondo piatto per le successive misurazioni della fluorescenza. Utilizzare il supporto semplice come grezzo per correggere l'autofluorescenza.
   3. Preparare 2,5 mL per pozzetto di Na-Fl (50 μM) in EBM-. Preriscaldare la soluzione di Na-Fl a 37 °C. Sostituire il terreno dal lato del sangue degli inserti con il terreno contenente Na-Fl. Avvia un timer non appena il supporto viene sostituito.
   4. Raccogliere con cura 100 μL di terreno sia dal sangue che dal lato cerebrale degli inserti a 5, 30, 60 e 120 minuti. Trasferire ogni campione in pozzetti separati della piastra nera a 96 pozzetti.
   5. Di conseguenza, sostituire il supporto raccolto dagli inserti per mantenere l'equilibrio del volume tra i due lati. Riposizionare gli inserti nell'incubatore tra ogni raccolta di campioni per ridurre al minimo le variazioni di temperatura.
   6. Quantificare la fluorescenza dai campioni raccolti, utilizzando un lettore di piastre con il filtro impostato su 480/560 nm (eccitazione ed emissione, rispettivamente).
      nota: La fluorescenza dal lato del cervello è quasi impercettibile al punto temporale di 5 minuti. Valori elevati rispetto al grezzo indicano una perdita/un danneggiamento della membrana dell'inserto o della barriera; pertanto, escluderli da ulteriori analisi. I valori di permeabilità Na-Fl attesi per il BBTB dovrebbero essere compresi tra 10-5 e 10-6 cm/s (Tabella 1).

Tabella 1: Valori della permeabilità sodio-fluoresceina (Na-Fl) (in centimetri al secondo) determinati in vitro nei sistemi di co-coltura indicati e in vivo in topi nudi NMRI. Dati provenienti da un esperimento rappresentativo (n = 3 topi).

Imitazione del BBTB murino	bEND3	bEND3+HIFko As	bEND3+GB	bEND3+HIFko As+GB	in vivo
Permeabilità (10–6 cm/s)	27.63	6.74	26,8	10.83	5.57
SD (10–6 cm/s)	3.45	3.01	7,99	2.65	2.19
Imitazione BBTB umana	HuAR2T	HuAR2T+hIA	HuAR2T+GB	HuAR2T+hIAs+GB
Permeabilità (10–6 cm/s)	104,92	47,4	89,08	48.24
SD (10–6 cm/s)	27.1	Ore 14.32	10.21	Ore 13.07

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiale e reagente
10 mL di pipetta sierologica	ThermoFisher Scientifico	170361
ABM Terreno basale, 500 mL	Lonza	CC-3187	Per astrociti umani primari. ABM+: contiene tutti gli additivi della miscela di integratori. ABM-: tutti gli additivi ad eccezione di rhEGF e FBS
Aquila media basale	ThermoFisher Scientifico	21010046	BME-1
Prosciutto F-12 Medium/Nutrient Modified Eagle's di Dulbecco	Gibco	Codice 21331-020	Specifico per la coltura delle sfere derivate dal paziente isolate nel nostro laboratorio, può variare per altre linee cellulari di glioma
Greiner CELLSTAR piastre a 96 pozzetti S	Sigma-Aldrich	Greiner 655090	Pozzetti in polistirene nero a fondo piatto (con fondo microtrasparente)
Sale sodico di fluoresceina	Sigma-Aldrich	Codice: F6377
Lettore di micropiastre FLUOstar Omega	BMG Labtech
cellule
bEND3	ATCC	Codice CRL-2299	Coltivato in: DMEM (1 g/L di glucosio) integrato con il 10% di FBS, 5 mL di L-glutammina e 5 mL di penicillina/streptomicina
HIFko ha immortalato gli astrociti di topo	Isolato nel laboratorio della dottoressa Gabriele Bergers	https://doi.org/10.1016/ S1535-6108(03)00194-6	Coltivato in: BME-1 integrato con il 5% di FBS, 5 mL di HEPES 1 M, 5 mL di piruvato di sodio 100 mM, 3 g di D-glucosio e 5 mL di penicillina/streptomicina
HuAR2T	Isolato nel laboratorio della dottoressa Dagmar Wirth	https://doi.org/10.1089/ dieci.tea.2009.0184	Coltivato in: EBM-2 con SupplementMix
Astrociti primari umani normali	Lonza	CC-2565	Coltivato in: ABM con SingleQuots