Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Omogeneizzazione
NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti a 4 °C.
- Aggiungere 1,5 mL di tricaina (15 mM) a piastre di Petri da 90 mm contenenti 50 larve in 50 mL di terreno embrionale E3 trattato con 200 μM di PTU per anestetizzarle terminalmente.
- Aspirare 10 larve anestetizzate dalle piastre di Petri con una pipetta di plastica Pasteur da 3 ml.
- Trasferisci le larve anestetizzate 10 per 10 in una capsula di Petri da 55 mm riempita con terreno embrionale E3 ghiacciato + tricaina.
- Sotto uno stereomicroscopio, allineare 10 larve al centro della capsula di Petri. Quindi, sezionare le teste larvali sopra il sacco vitellino utilizzando micro-forbici chirurgiche (escludere la vescica natatoria per evitare teste galleggianti).
- Aspirare le teste dalle piastre di Petri con una pipetta sfusa in plastica Pasteur da 3 ml. Attendere che tutte le testine si raccolgano all'interno del puntale della pipetta, quindi trasferirle in un omogeneizzatore di vetro contenente 1 ml di Terreno A ghiacciato (trasferire in un volume minimo per ridurre la diluizione del Terreno A di E3 + Tricaina). Mantieni l'omogeneizzatore di vetro sul ghiaccio. Utilizzare un omogeneizzatore per condizione sperimentale.
- Sostituire ogni piccola capsula di Petri contenente E3 + Tricaina ghiacciata con una nuova ogni 30 minuti per garantire che la transezione venga eseguita in E3 freddo + Tricaina.
- Sostituisci il mezzo A ghiacciato nell'omogeneizzatore di vetro quando il colore inizia a sbiadire.
NOTA: Una diluizione può alterare il tessuto della testa a causa delle variazioni di temperatura.
- Una volta raccolte tutte le testine (600 testine/condizione), rimuovere il volume massimo di Terreno A dall'omogeneizzatore in vetro e sostituirlo con 1 mL di Terreno A fresco e ghiacciato.
- Distruggi il tessuto cerebrale con un omogeneizzatore di vetro stretto sul ghiaccio. Esegui 40 cicli di frantumazione e turni per larve da 3-5 dpf e 50 per larve da 7 e 8 dpf.
- Aggiungere 2 mL di Media A alla sospensione cellulare (1 mL di Media A/200 teste), che diluirà le cellule e ridurrà la loro agglomerazione con la mielina per facilitarne la separazione durante la centrifugazione in mezzo a gradiente di densità.
- Per eliminare l'agglomerazione cellulare, far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 μm posizionato sopra una provetta di falco fredda da 50 mL mantenuta su ghiaccio. Ripetere questa operazione 3 volte.
- Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in provette fredde da 1,5 mL e centrifugarle a 300 g per 10 min a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante utilizzando una siringa da 10 ml + ago 23G x 1''.
- Risospendere il pellet cellulare con 1 mL di terreno ghiacciato con gradiente di densità del 22% delicatamente sovrapposto a 0,5 mL di DPBS ghiacciato 1x (non mescolarli, si vedrà un'interfase tra le due soluzioni).
- Centrifuga i tubi a 950 g senza freno e accelerazione lenta per 30 minuti a 4 °C.
NOTA: Questo passaggio separa la mielina dalle altre cellule sequestrandola all'interfase del mezzo di gradiente di densità DPBS 1x e 22%, mentre le cellule si pellettizzano sul fondo del tubo. La rimozione della mielina è più efficiente quando la concentrazione cellulare non è troppo alta.
- Utilizzando una siringa da 10 mL + ago 23G x 1'' scartare il massimo di DPBS, il mezzo di gradiente di densità e la mielina intrappolata nella loro interfase.
- Lavare le cellule con 0,5 mL di Media A + 2% di siero di capra normale (NGS), quindi centrifugare le provette a 300 g per 10 minuti a 4 °C.
- Scartare la quantità massima di surnatante, quindi raggruppare tutti i pellet cellulari della stessa condizione sperimentale in 1 mL di terreno A + 2% NGS.
- Se le cellule di interesse esprimono macrofagi/microglia fluorescenti simili a proteine da mpeg1:eGFP o neuroni da pesci transgenici NBT:DsRed, far passare la sospensione cellulare attraverso un tappo filtrante cellulare da 35 μm e trasferirle in provette FACS fredde da 5 mL su ghiaccio, al riparo dalla luce.
NOTA: In alternativa, è possibile eseguire l'immunocolorazione della microglia.
