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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Immunocolorazione della microglia
NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti a 4 °C.
- Risospendere il pellet cellulare ottenuto da cellule di coltura cerebrale con 0,3 mL di Media A + 2% di siero di capra normale o NGS. Dividerli in 3 provette da 1,5 mL: una per le cellule non colorate per misurare l'autofluorescenza delle cellule di interesse, la seconda per l'anticorpo secondario (1/200) per misurare il legame non specifico dell'anticorpo secondario alla microglia e la terza come test (anticorpo monoclonale di topo 4C4 (specifico per la microglia) (1/20) + anticorpo secondario (1/200)).
- Aggiungere un basso contenuto di endotossina, privo di azide (LEAF) all'1% alle cellule (tutte le provette) per bloccare le interazioni CD16/CD32 con il dominio Fc delle immunoglobuline. Incubare le cellule per 10 minuti con una leggera agitazione ogni 5 minuti.
- Aggiungere l'anticorpo 4C4 (1/20) alle cellule (provetta 3) e incubare per 30 minuti agitando delicatamente ogni 10 minuti.
- Centrifugare i tubi a 300 g per 10 minuti a 4 °C, quindi eliminare il surnatante.
- Lavare una volta con 0,5 mL di Terreno A + 2% NGS, quindi centrifugare le provette a 300 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Risospendere il pellet cellulare con 0,5 ml di Media A + 2% NGS e incubare le cellule con LEAF all'1% per 10 minuti con leggera agitazione ogni 5 minuti.
- Aggiungere l'anticorpo secondario (1/200) alle cellule (provette 2 e 3). Incubare le cellule per 30 minuti con una leggera agitazione ogni 10 minuti e una protezione dalla luce.
- Centrifugare i tubi a 300 g per 10 minuti a 4 °C, quindi eliminare il surnatante.
- Lavare due volte con 0,5 mL di Media A + 2% NGS, quindi risospendere il pellet cellulare con 1 mL di Media A + 2% NGS.
- Far passare la sospensione cellulare attraverso un tappo filtrante da 35 μm e trasferirla in provette fredde da 5 mL attivate da fluorescenza o in provette FACS su ghiaccio, al riparo dalla luce.
2. Ordinamento delle celle (FACS)
NOTA: Esegui tutti i passaggi a 4 °C.
- Ordina neuroni, macrofagi/microglia e microglia utilizzando un FACS.
NOTA: Questo passaggio viene solitamente eseguito da un membro del personale della struttura FACS e le impostazioni dipendono dal tipo di apparecchiatura utilizzata.
- Aggiungere DAPI a una concentrazione di 1 μg/mL in ciascuna provetta FACS per marcare le cellule morte.
- Imposta FACS e seleziona neuroni, macrofagi/microglia o microglia da tutte le cellule cerebrali. Separare le celle dai detriti in funzione delle loro dimensioni e granularità, quindi portare le singole celle mediante dispersione diretta e laterale. Escludere le cellule morte mediante l'etichettatura DAPI dalle cellule vive. Identificare neuroni, macrofagi/microglia o microglia in base alla rispettiva colorazione positiva.
- Raccogliere le cellule in provette da 1,5 mL contenenti 1 mL di Media A ghiacciata + 2% NGS su ghiaccio. Utilizzare provette diverse per ogni tipo di cellula.
- Centrifugare le provette a 300 x g per 10 minuti a 4 °C e quindi scartare il surnatante.
- Lavare una volta con 0,5 ml di terreno A, quindi scartare il massimo di surnatante.