Strumenti di editing delle basi mediati da CRISPR: una tecnica di editing del genoma per indurre una sostituzione di basi mirata

1. Creazione di varianti BRCA1 utilizzando strumenti di modifica di base mediati da CRISPR

NOTA: Se non vengono utilizzate linee cellulari HAP1-BE3, il DNA plasmidico codificante BE3 può essere co-trasfettato con il gRNA mirato a BRCA1. Rispetto alla co-trasfezione di plasmidi BE3 e gRNA, la trasfezione del plasmide gRNA in cellule HAP-BE3 induce un efficiente editing delle basi fino a 3 volte nel locus target nelle nostre mani.

1. Seminare 5 x 10 5 cellule HAP1-BE3 (o cellule HAP1 in caso di metodi di co-trasfezione) per pozzetto in piastre a 24 pozzetti 1 giorno prima della trasfezione. Al momento della trasfezione, le cellule vengono coltivate per raggiungere una densità appropriata (70%-80% di confluenza).
2. Trasfettare i gRNA mirati a BRCA1 utilizzando i reagenti di trasfezione acquistati (Tabella dei materiali) secondo il protocollo del produttore. Utilizzare 1 μg di gRNA mirato a BRCA1 (con 1 μg di DNA plasmidico codificante BE3 in caso di metodi di co-trasfezione) per indurre la conversione da C:G a T:A nei siti bersaglio di BRCA1. Incubare le cellule a 37 °C e sottocoltivare ogni 3-4 giorni.
3. Raccogliere i pellet cellulari 3, 10 e 24 giorni dopo la trasfezione per analizzare l'efficienza dell'editing di base (i campioni a partire da 3 giorni dopo la trasfezione vengono analizzati riclassificandoli come campioni del giorno 0).
4. Estrarre il DNA genomico utilizzando il kit di purificazione del DNA genomico (Tabella dei materiali).
   NOTA: Si consiglia di ottimizzare le condizioni di trasfezione con un rapporto variabile tra reagente e DNA. La condizione ottimale per la trasfezione di HAP1 è il rapporto 4:1 tra reagente e DNA nelle nostre mani.