Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Installazione del software
- Seguire le istruzioni per installare il software da https://github.com/bsbrl/Autoinjector.
2. Preparazione di reagenti e pipette
- Agarosio: preparare l'agarosio al 3% sciogliendo separatamente 3 g di agarosio ad ampio intervallo e 3 g di agarosio a basso punto di fusione in 100 ml di PBS per colture cellulari in due flaconi di vetro separati da 200 ml, rispettivamente. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 3 mesi.
- Soluzione di Tyrode: Sciogliere 1 g di bicarbonato di sodio e sale di Tyrode (utilizzare il contenuto dell'intera bottiglia) e 13 ml di 1 M HEPES in 1 litro di acqua distillata. Regolare il pH a 7,4. Filtrare la soluzione attraverso un filtro per flaconi da 0,2 μm.
- Terreno di coltura a fette (SCM): aggiungere 10 ml di siero di ratto, 1 ml di glutammina 2 mM, 1 ml di penicillina-streptomicina (100x), 1 ml di integratore di N-2 (100x), 2 ml di integratore di B27 (50x) e 1 ml di tampone HEPES (pH 7,3) in 84 ml di terreno neurobasale. Aliquotare 5 mL di SCM in provette da 15 mL. Conservare a -20 °C.
- Terreno di microiniezione indipendente da CO2 (CIMM): preparare 5 soluzioni a basso contenuto di glucosio modificate con DMEM (senza rosso fenolo) sciogliendo la polvere in 200 ml di acqua distillata. Filtrare la soluzione attraverso un filtro per flaconi da 0,2 μm (per la polvere di DMEM, utilizzare il contenuto dell'intero flacone). Per preparare 100 mL di CIMM, mescolare 20 mL di 5 mL di soluzione modificata DMEM, 1 mL di tampone HEPES, 1 mL di integratore di N2 (100x), 2 mL di integratore di B27 (50x), 1 mL di penicillina-streptomicina (100x), 1 mL di 2 mM di glutammina e 74 mL di acqua distillata. Conservare la soluzione a 4 °C.
- Tampone di ricostituzione: Preparare il tampone di ricostituzione sciogliendo 262 mM di NaHCO₃, 0,05 N NaOH, 200 mM di HEPES in acqua distillata. Sterilizzare la soluzione mediante filtrazione attraverso un sistema di filtraggio da 0,22 μm in un flacone di vetro sterile. Aliquotare 500 μl di tampone di ricostituzione in provette ermetiche per microcentrifuga. Conservare a 4 °C.
- Stock colorante per microiniezione: Sciogliere il destrano marcato in fluorescenza in acqua distillata priva di RNasi (concentrazione finale 10 μg/μL). Preparare aliquote da 5 μL e conservare a -20 °C fino al momento dell'uso.
- Estrarre le pipette per microiniezione dai capillari in vetro borosilicato (diametro esterno 1,2 mm, diametro interno 0,94 mm) utilizzando l'estrattore per micropipette. Proteggere le pipette dalla polvere. Non conservare le pipette per più di 2-3 giorni. Per questo esperimento, i parametri di trazione erano CALORE: temperatura della rampa +1 – 5; TIRARE: 100; VEL: 110; DEL: 100. HEAT e VEL sono i parametri che influenzano la maggior parte della forma e delle dimensioni della pipetta.
nota: La pipetta per microiniezione ottimale ha una punta lunga e flessibile, per evitare danni alle cellule durante la microiniezione.
3. Preparazione della fetta di tessuto
- Sciogliere l'agarosio ad ampio raggio al 3% utilizzando un forno a microonde prima della dissezione del tessuto cerebrale. Non lasciare solidificare l'agarosio tenendolo a bagnomaria a 37 °C prima di essere incorporato. Assicurarsi che le pipette siano protette dalla polvere. Non conservare le pipette per più di 2-3 giorni.
- Scongelare un'aliquota di SCM e scaldare 10-12 mL di CIMM e 20 mL di soluzione di Tyrode a 37 °C utilizzando un bagnomaria.
- Miscelare il tracciante fluorescente (Dextran-3000 o Dextran-10000-Alexa coniugato; concentrazione finale 5-10 μg/μL) con le altre sostanze chimiche da iniettare. Centrifugare la soluzione per microiniezione a 16.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta. Conservare la soluzione di microiniezione in ghiaccio fino al momento dell'uso.
- Utilizzare le teste degli embrioni di topo E13.5-E16.5 per preparare fette di tessuto organotipico del telencefalo. Rimuovere la pelle e aprire il cranio usando la pinza, muovendosi lungo la linea mediana. Sezionare il cervello embrionale dal cranio aperto e rimuovere le meningi che coprono il tessuto cerebrale a partire dal lato ventrale del cervello. Lasciare l'intero cervello sezionato nella soluzione di Tyrode su un blocco riscaldante a 37 °C.
nota: Tutte le fasi di dissezione descritte al punto 3.4 devono essere eseguite in soluzione di Tyrode preriscaldata.
- Versare l'ampia gamma di agarosio fuso in uno stampo da inclusione usa e getta. Quando l'agarosio si è raffreddato a 38-39 °C, trasferire con cura il cervello (massimo 4) utilizzando una pipetta Pasteur. Utilizzare sempre le punte di taglio per questo passaggio.
- Mescola l'agarosio intorno al tessuto usando una spatola o un paio di pinze Dumont #1 senza toccare il tessuto. Lasciate solidificare l'agarosio a temperatura ambiente. Una volta che l'agarosio si è solidificato, tagliare l'agarosio in eccesso che circonda il tessuto.
- Riempire il vassoio del tampone con PBS. Orientare il cervello con l'asse rostro-caudale del tessuto perpendicolare al vassoio (utilizzare come punto di riferimento i bulbi olfattivi, che rappresentano la parte più rostrale del cervello). Tagliare fette da 250 μm utilizzando un vibratomo.
- Riempire una piastra di Petri da 3,5 cm con 2 ml di terreno preriscaldato. Usando una pipetta di plastica Pasteur, trasferisci le fette (10-15) in questo piatto. Una volta fatto, sposta la capsula di Petri con le fette nell'incubatore di coltura a fette. Mantenere le fette a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 40% di O2 / 5% CO2 / 55% N2 fino al momento dell'uso.
4. Microiniezione
- Accendi il computer, il microscopio, la fotocamera del microscopio, i manipolatori, l'impianto a pressione e il sensore di pressione. Caricare l'applicazione facendo clic sul file "launchapp.py" nella cartella principale scaricata da GitHub e specificare le impostazioni del dispositivo nella schermata popup (vedere il passaggio 1.1 per le istruzioni di installazione).
- Creare una pressione verso l'esterno per evitare intasamenti indesiderati prima di immergere la pipetta nella soluzione. Per applicare pressione alla pipetta, far scorrere la barra della pressione di compensazione al 24-45% e fare clic su Imposta valori. Quindi, regolare la pressione a una pressione sufficiente ruotando la manopola della valvola di pressione meccanica su 1–2 PSI (69–138 mbar) come indicato dal sensore di pressione.
- Trasferire le fette in una capsula Petri da 3,5 cm contenente 2 ml di CIMM preriscaldato. Posizionare le fette da microiniettare al centro della capsula di Petri. Trasferire la capsula di Petri nella fase di microiniezione preriscaldata (37 °C).
- Caricare la pipetta per microiniezione con 1,4-1,6 μL di soluzione microiniettata (dal passaggio 3.3) utilizzando una pipetta di plastica a punta lunga. Inserire la pipetta per microiniezione sul supporto della pipetta.
- Utilizzando l'ingrandimento più basso del microscopio, mettere a fuoco la fetta e guidare la micropipetta su questo campo visivo (FOV) in modo che sia messa a fuoco sullo stesso piano del target della fetta. Passa l'output del microscopio alla fotocamera per vedere il FOV nell'applicazione.
- Fare clic sul pulsante di ingrandimento in alto a sinistra dell'interfaccia per avviare la calibrazione del dispositivo. Una finestra chiederà di selezionare l'ingrandimento. Selezionare l'ingrandimento 10x o l'ingrandimento impostato sull'obiettivo (ad esempio, 4x, 10x, 20x, 40x) e premere Ok. Il software presuppone che l'obiettivo interno sia 10x (l'ingrandimento più comune dell'obiettivo).
- Rimettere a fuoco la punta della pipetta utilizzando la rotella micrometrica del microscopio e fare clic sulla punta della pipetta con il cursore. Quindi, premere il pulsante del passaggio 1.1 e premere OK nella finestra popup. La pipetta si muoverà in direzione Y. Fare clic sulla punta della pipetta e premere il pulsante del passaggio 1.2. Infine, immettere 45 nella casella Angolo pipetta e premere il tasto Imposta angolo.
- Inserire i parametri desiderati nel pannello di controllo della microiniezione automatizzata. Per la microiniezione nei progenitori apicali, impostare la distanza di iniezione a 20-40 μm e la profondità a 10-15 μm. Per la microiniezione nei neuroni, impostare la distanza di iniezione a 30-40 μm dal lato basale e la profondità a 10-30 μm a seconda di ciò che si sta mirando. Impostare sempre la velocità al 100%. Fare clic su Imposta valori.
nota: La distanza di avvicinamento è la distanza che la pipetta estrae dal tessuto prima di passare alla distanza di iniezione successiva, la profondità è la profondità nel tessuto in cui va la microiniezione, la spaziatura è la distanza lungo la linea tra le iniezioni sequenziali, la velocità è la velocità della pipetta in μm/s.
- Fare clic sul pulsante Disegna bordo e trascinare il cursore lungo la traiettoria desiderata nella finestra popup per definire la traiettoria dell'iniezione. Per la microiniezione di cellule staminali progenitrici, viene mirato il lato ventrale della superficie del telencefalo. Portare la pipetta all'inizio della linea e fare clic sulla punta della pipetta. Fare clic su Esegui traiettoria per avviare la microiniezione. Ripetere questo passaggio per ogni piano di iniezione mirato (di solito per 3-4 piani con 40-75 iniezioni per piano).
