Cromatografia liquida con interazione idrofila: una tecnica per separare gli analiti polari idrofili utilizzando perle idrofile

Abstract

Fonte: Liu, D., et al. Analisi delle immunoglobuline G N-glicani mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video dimostra il principio della separazione dei composti polari idrofili utilizzando la cromatografia liquida con interazione idrofila. Questa tecnica aiuta nella purificazione di vari analiti polari, compresi gli N-glicani.

Protocollo

1. Cromatografia di interazione idrofila e analisi dei glicani

1. Condizionamento degli strumenti UPLC e preparazione delle fasi mobili
   1. Preparare le fasi mobili tra cui il solvente A: 100 mM di formiato di ammonio (pH = 4,4), il solvente B: 100% acetonitrile, il solvente C: 90% di acqua ultrapura (10% di metanolo) e il solvente D: 50% di metanolo (acqua ultrapura).
   2. Aprire il software per controllare le fasi mobili.
   3. Lavare gli strumenti UPLC a una velocità di flusso di 0,2 mL/min (50% solvente B e 50% solvente C) bilanciando per 30 minuti, quindi a una velocità di flusso di 0,2 mL/min (25% solvente A e 75% solvente B) bilanciando per 20 minuti, quindi una velocità di flusso di 0,4 mL/min bilanciamento.
2. Sciogliere gli N-glicani premarcati con 2-amminobenzamide (2-AB) in 25 μL di una miscela di acetonitrile al 100% e acqua ultrapura in rapporto 2:1 (v/v). Quindi, centrifugare a 134 × g per 5 minuti (4 °C) e caricare 10 μl di N-glicani marcati negli strumenti UPLC.
3. Separare gli N-glicani marcati a una velocità di flusso di 0,4 mL/min con un gradiente lineare dal 75% al 62% di acetonitrile per 25 minuti. Quindi, eseguire un'esecuzione analitica mediante scala di calibrazione del destrano/colonna di glicopeptidi su un UPLC a 60 °C (qui, i campioni sono stati mantenuti a 4 °C prima dell'iniezione).
4. Rileva la fluorescenza dell'N-glicano a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 330 nm e 420 nm.
5. Integrare i glicani in base alla posizione del picco e al tempo di ritenzione.
6. Calcolare il valore relativo di ciascun picco di glicani (GP)/ tutti i picchi di glicani (GP) (percentuale, %) come segue: GP1: GP1/GPs*100, GP2: GP2/GPs*100, GP3: GP3/GPs*100, ecc.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-amminobenzammide, 2-AB	Sigma, Cina
acetonitrile	Fornitore verificato - Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina
Formiato di ammonio	Fornitore verificato - Beijing Minruida Technology Co., Ltd.
Scala di calibrazione destrano/colonna glicopeptidica	Fornitore verificato - Watts technology Co., Ltd, Cina
Potenziamento 3.0	Waters technology Co., Ltd, America
Kit di etichettatura GlycoProfile 2-AB	Sigma, Cina
metanolo	Fornitore verificato - Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Cina
Contatore dell'acqua pura Milli-Q	Millipore Co., Ltd, America	202-2AB
Pistola per liquidi di trasferimento	Smer Fell Science and Technology Co., Ltd, Cina	Vantaggio A10
Frigorifero a bassissima temperatura	Thermo Co., Ltd, America	PB-10
Cromatografia liquida ad alte prestazioni	Fornitore verificato - Watts technology Co., Ltd, Cina
Pompa a vuoto	Fornitore verificato - Watts technology Co., Ltd, Cina	4672100, 0,5-10μl e 10-100μl e 20-200μl e 1000μl