1. Derivatizzazione a fluorescenza degli acidi sialici
- Preparare 10 mL di soluzione OPD, composta da 100 mg di o-fenilendiammina e 208 mg di idrogeno solfito di sodio in 10 mL di H₂O distillato.
- Aggiungere 20 μl di soluzione OPD ai campioni di acido sialico. Agitare energicamente per 30 s e incubare i campioni per 4 ore a 80 °C al buio (cioè avvolgere le microprovette in un foglio di alluminio).
- Lasciare raffreddare i campioni per 5 minuti, aggiungere 80 μl di H₂O distillato e centrifugare le provette a 14.000 x g per 1 minuto.
- Trasferire 80 μl dal surnatante in una fiala HPLC ad alto recupero da 300 μl. I campioni di acido sialico derivatizzato possono essere conservati a 4-6 °C per un massimo di una settimana.
2. Analisi HPLC dei derivati dell'acido sialico
- Analizza i campioni utilizzando un sistema HPLC standard collegato a un rivelatore di fluorescenza online.
- Per l'analisi utilizzare una colonna C18 a fase inversa con dimensioni standard di 250 mm di lunghezza e 4,6 mm di diametro.
- Preparare il solvente A diluendo 200 mL di soluzione madre con 800 mL di acqua di grado LCMS (LCMS - spettrometria di massa per cromatografia liquida). La soluzione madre stessa può essere preparata come segue:
- Aggiungere 46 g di acido formico a 800 ml di H₂O di grado LCMS.
- Regolare il pH a 4,5 aggiungendo goccia a goccia una soluzione di idrossido di ammonio (puriss. p.a.).
- Trasferire il solvente in un cilindro graduato e riempire fino a 1.000 ml con H₂O di grado LCMS. Questa soluzione madre può essere conservata a 4-6 °C per un massimo di 3 mesi.
- Per il solvente B, utilizzare acetonitrile di grado LCMS.
- Separare i derivati degli acidi sialici a una velocità di flusso di 1 mL/min con la seguente eluizione a gradiente:
- Iniziare aggiungendo il 10% di solvente B miscelato al solvente A.
- Da 0 min a 15 min, aumentare gradualmente la proporzione di solvente B con un gradiente lineare fino al 60%.
- Da 15 minuti a 16 minuti, aumentare rapidamente la proporzione di solvente B con un gradiente lineare dal 60% al 90%. In questo modo si avvia il lavaggio della colonna HPLC.
- Per lavare ulteriormente la colonna HPLC, mantenere il livello di solvente B al 90% tra 16 min e 18 min prima di ridurre gradualmente il livello di solvente B al 10% tra 18 min e 19 min.
- Riequilibrare la colonna HPLC alle condizioni iniziali del 10% B tra 19 e 24 min.
- Iniettare 50 μl di campione nel sistema HPLC.
- Monitorare gli eluenti utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione del rivelatore a fluorescenza di 373/448 nm e gli acidi sialici derivatizzati possono essere attesi con tempi di ritenzione approssimativi di 9 minuti (per Neu5Gc-OPD) e 10 minuti (per Neu5Ac-OPD).
- Calcolare la quantità relativa di Neu5Gc (FNeu5Gc) dalle aree di picco di fluorescenza di Neu5Ac (ANeu5Ac) e Neu5Gc (ANeu5Gc) come segue:
FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). Nel caso dei campioni di latte e fegato del topo knock-out omozigote Cmah, il FNeu5Gc dovrebbe essere dello 0%, mentre i valori di FNeu5Gc dei topi eterozigoti e wild-type possono variare notevolmente a seconda dell'età del topo e del tipo di tessuto (tra il 2% e il >90%) con margini di errore attesi del ±12%.