Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Misurare il volume embrionale utilizzando lo spostamento dell'acqua
NOTA: In questo protocollo, vengono utilizzati embrioni post-fecondazione (hpf) di 24 ore (Figura 1). Gli embrioni utilizzati nelle misurazioni del volume non vengono utilizzati nell'analisi dell'etanolo.
- Mettere 10 embrioni e il liquido extraembrionale in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contrassegnata a un volume di 250 μL (Figura 2A). Aggiungere acqua alla linea di riempimento da 250 μl (vedere l'esempio con acqua colorata nella Figura 2B).
- Ripetere il passaggio 1.1 per impostare i recipienti per gli embrioni a cui sono stati rimossi i corioni.
- Per rimuovere il corion, mettere gli embrioni nei loro corioni in una piastra di Petri da 100 mm con 2 mg/mL di cocktail di proteasi in terreno embrionale a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti. Ogni pochi minuti, agitare delicatamente gli embrioni per rompere il corion.
- Una volta che tutti gli embrioni sono liberi dal loro coriono, rimuovere gli embrioni dechorionati dal cocktail di proteasi/terreno embrionale e metterli in una nuova piastra di Petri da 100 mm con terreno embrionale fresco per lavare gli embrioni. Ripetere questa fase di lavaggio ancora 1 volta (per un totale di 2 lavaggi). Trasferire gli embrioni in una capsula di Petri fresca da 100 mm.
- Utilizzando la punta più piccola possibile e senza danneggiare gli embrioni, rimuovere con cura tutto il liquido intorno agli embrioni utilizzando un micropipettor p200 (Figura 2C) e pesare l'acqua con una bilancia con una precisione di <0,1 mg. Per determinare il volume del campione di 10 embrioni, sottrarre il peso/volume dell'acqua (1 ml di acqua = 1 g di acqua) prelevata da 250 μl. Per determinare il volume di un singolo embrione, dividere la differenza tra 250 μl e il peso dell'acqua rimossa per 10,
2. Trattamento degli embrioni con etanolo
- Raccogli gli embrioni dalle vasche di accoppiamento e mettili in una capsula di Petri standard da 100 mm. Contare non più di 100 embrioni per singola capsula di Petri e incubare a 28,5 °C.
nota: Se il corion deve essere rimosso (passaggio 1.2), deve essere rimosso prima di aggiungere etanolo.
- A 6 hpf, aggiungere fino a 100 embrioni a una nuova piastra di Petri standard da 100 mm con terreno embrionale o terreno embrionale + 1% di etanolo (v/v). Coprire, ma NON sigillare la capsula di Petri. Mettere gli embrioni in un'incubatrice a bassa temperatura impostata a 28,5 °C per 18 ore, o fino a quando gli embrioni raggiungono il punto di sviluppo di 24 hpf.
3. Preparazione del flusso di lavoro prima di elaborare gli embrioni per la gascromatografia nello spazio di testa
- Preparare una soluzione di 5 M di NaCl in acqua (saranno necessari 450 μl per provetta) per denaturare tutte le proteine e prevenire il metabolismo dell'etanolo. Preparare il cocktail di proteasi a una concentrazione di 2 mg/mL in terreno embrionale.
- Etichettare una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml e una fiala per gascromatografo da 2 ml per ogni campione. Etichettare ulteriori fiale per gascromatografo da 2 ml per gli standard di etanolo descritti di seguito, nonché aria, acqua e i bianchi del cocktail di NaCl/proteasi 5 M.
- Impostare tre micropipettatori p200, due da 50 μl e il terzo da 200 μl, un micropipettatore p1000 da 450 μl e un micropipettatore p2 da 2 μl. Per le pipette di vetro utilizzate per trasferire gli embrioni dalle piastre di Petri alle provette per microcentrifuga da 1,5 ml, passare rapidamente la punta della pipetta attraverso una fiamma per levigare i bordi per non danneggiare gli embrioni quando li si aspira nella pipetta.
4. Trattamento degli embrioni per la gascromatografia nello spazio di testa
NOTA: Sia gli embrioni nei loro corioni che quelli precedentemente rimossi dai loro corioni sono trattati allo stesso modo per coerenza nel calcolo dei fattori di diluizione.
- Utilizzando i due micropipettatori p200 impostati su 50 μL, aspirare 50 μL della soluzione cocktail di proteasi in uno e aspirare 50 μL di acqua nel secondo.
- Utilizzando la pipetta di vetro e il micropipettatore, posizionare rapidamente 10 embrioni (dal passaggio 2.2) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e chiudere il tappo (come descritto nella Figura 2A). Ripetere l'operazione per tutti i campioni da testare, i controlli e gli embrioni trattati con etanolo.
- Utilizzando il micropipettatore p200 impostato su 200 μl, aprire rapidamente il tappo e rimuovere tutto il terreno embrionale residuo (come descritto nella Figura 2C). Posizionare rapidamente la pipetta contenente 50 μL di acqua nella provetta e aggiungere rapidamente ma delicatamente (per non danneggiare gli embrioni), quindi rimuovere l'acqua. Aggiungere rapidamente 50 μl della soluzione cocktail di proteasi dal pipettatore in attesa e chiudere il tappo della provetta (Figura 2D).
nota: Eseguire questo processo un campione alla volta.
- Lasciare riposare il campione a RT per 10 minuti per consentire al cocktail di proteasi di degradare il corion. Quindi, aggiungere rapidamente 450 μl di NaCl 5 M e chiudere il tappo della provetta (Figura 2E). Agitare i campioni per 10 min. Per accelerare il processo, impostare il miscelatore in modo che funzioni più campioni contemporaneamente.
NOTA: Aggiungere una piccola quantità (~100 μL) di una miscela di perle di silice (2 dimensioni, 0,5 mm e 1 mm) a qualsiasi provetta con embrioni di età superiore a 24 hpf. Negli embrioni più vecchi, la notocorda rimarrà intatta indipendentemente da quanto tempo sono omogeneizzati.
- Dopo l'omogeneizzazione per 10 minuti, rimuovere rapidamente 2 μL di surnatante embrionale omogeneizzato e aggiungerlo a una fiala di gascromatografo. Sigillare rapidamente il flaconcino con il tappo in politetrafluoroetilene.
5. Preparazione degli standard per i terreni e l'etanolo
- Per preparare gli standard dei terreni, diluire il terreno di un fattore 10 con una soluzione cocktail di NaCl/proteasi 5 M. Aggiungere 2 μl di ciascun campione in una fiala per gascromatografo e sigillare con un tappo in politetrafluoroetilene.
- Per preparare gli standard sull'etanolo, creare una diluizione seriale di etanolo al 100% in una soluzione cocktail di NaCl/proteasi 5 M alle seguenti concentrazioni: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 e 40 mM. Aggiungere 2 μl di ciascuno standard a una fiala per gascromatografo e sigillare con un tappo in politetrafluoroetilene.
6. Preparazione della gascromatografia nello spazio della testa
NOTA: La gascromatografia nello spazio di testa viene utilizzata per quantificare i livelli di etanolo, non per la separazione.
- Impostare il riscaldatore dell'autocampionatore a 58 °C e accenderlo. Lasciare che il riscaldatore raggiunga i 58 °C e accendere le linee dell'aria e dell'idrogeno gassoso che alimentano il gascromatografo (per la ionizzazione di fiamma utilizzata per quantificare l'etanolo).
NOTA: La psi deve essere impostata per far funzionare correttamente il cromatografo secondo le specifiche del produttore. Assicurati che la linea dell'elio sia attiva e impostata sul psi corretto.
- Per il setto, assicurarsi che il numero di campioni iniettati non sia >100. Per la fibra di iniezione, assicurarsi che il numero di campioni iniettati non sia >500.
NOTA: Se una delle due è superiore alla quantità di iniezioni, sarà necessario sostituirle prima di eseguire i campioni di prova.
- Accendere il software di analisi e assicurarsi che la workstation sia configurata correttamente. Memorizza tutti i dati secondo gli standard del laboratorio/reparto. Creare un nuovo elenco di esempi per gli esempi da eseguire.
- Avviare il metodo di avvio e attendere che il rilevatore a ionizzazione di fiamma si stabilizzi prima di eseguire i campioni. Una volta stabile, esegui il metodo di avvio del software per pulire la fibra.
7. Misurazioni del campione utilizzando la gascromatografia nello spazio di testa
- Una volta completato il metodo di avvio, creare 1 nuova riga per ogni campione nell'elenco dei campioni. Dal menu dei metodi nel software di analisi, caricare 436 Corrente spme etanolo 2013 3min assorbire 2_5min rg run. METH per ogni campione nell'elenco dei campioni.
- Compila l'elenco dei campioni, iniziando con gli spazi vuoti del cocktail di aria, acqua, 5 M NaCl/proteasi. Quindi inserire gli standard in ordine, da 0,3125 a 40 mM. Segui gli standard con un secondo giro di aria, acqua e 5 M di NaCl/proteasi grezze.
- Inserire tutti i campioni di surnatante embrionale omogeneizzato da testare, dalla concentrazione di etanolo più bassa a quella più alta prevista. Termina partecipando a un terzo e ultimo round di cocktail in aria, acqua e 5 M di NaCl/proteasi.
- Aggiungere le fiale del gascromatografo all'autocampionatore nell'ordine in cui sono stati inseriti i campioni. Lasciare riscaldare i campioni per 10-15 minuti. Avviare l'esempio viene eseguito nel software.
- Dopo che tutti i campioni e gli spazi vuoti finali sono stati eseguiti, attivare il metodo di spegnimento nel software aggiungendo un campione finale nell'elenco dei campioni ed eseguendo lo standby. METANFETAMINA. Eseguire il backup di tutti i dati acquisiti durante le esecuzioni di esempio. Spegnere l'apparecchiatura nel seguente ordine: riscaldatore dell'autocampionatore, serbatoio dell'idrogeno e, solo dopo che la temperatura del cromatografo raggiunge i 30 °C, il serbatoio dell'aria. Lasciare acceso il serbatoio dell'elio per preservare la colonna di cera.
8. Integrazione del picco di etanolo del campione e analisi della concentrazione del campione
NOTA: Tutti i valori da 8.3 in poi sono stati calcolati in un file excel che tutte le equazioni hanno precompilato.
- Una volta completato il metodo di spegnimento, fare clic su Apri cromatogramma. Aprire la cartella contenente i risultati. I campioni vengono integrati automaticamente in questo programma.
- Nei risultati, assicurarsi che siano stati integrati i picchi corretti (picchi di etanolo compresi tra 2 e 2,5). Una volta confermati tutti i campioni, stampare o esportare i risultati.
- Traccia l'altezza di picco degli standard di etanolo su un grafico. Calcola la pendenza, l'intercetta Y e i valori di R2 per gli standard di etanolo (R2 dovrebbe essere >0,99).
nota: Questi valori verranno utilizzati per determinare la concentrazione di etanolo dall'altezza del picco del campione.
- Per ogni campione, sottrarre l'altezza del picco del campione dall'intercetta Y degli standard di etanolo. Dividere questo valore per la pendenza degli standard di etanolo per ottenere il valore di etanolo per ciascun campione nelle fiale GC.
- Per calcolare la concentrazione di etanolo negli embrioni, calcolare prima il fattore di diluizione per ogni campione. Prendere la misura del volume calcolata al punto 1.3 di questo protocollo e dividerla per la misura del volume più 500 μL. Questo rappresenta la soluzione cocktail di NaCl/proteasi 5 M aggiunta a ciascun campione durante il trattamento degli embrioni (fasi 4.3 e 4.4).
- Utilizzando questo fattore di diluizione del campione, moltiplicare per il valore dell'etanolo del campione per ciascun campione. I risultati saranno in concentrazione mM. Calcolare i campioni di riferimento del terreno moltiplicando il valore dell'etanolo del terreno per il fattore di diluizione di 10,
