1. Preparazione di tamponi e soluzioni
NOTA: Tutti i buffer e le soluzioni utilizzate nel protocollo sono riassunti nella Tabella 1. I volumi dati dei tamponi sono sufficienti per preparare ed eseguire 10 campioni. Tutti i tamponi possono essere conservati a +4 °C per un massimo di un anno.
- Preparare 20 mL di tampone gel 3x contenente acido aminocaproico 1,5 M, 150 mM di Bis-tris in acqua distillata (dH2O). Regolare il pH a 7,0.
- Preparare 10 mL di acido 2 M aminocaproico in dH2O.
- Preparare 1 mL di tampone mitocondriale combinando quanto segue: 0,5 mL di tampone gel 3x, 0,5 mL di acido aminocaproico 2 M e 4 μL di EDTA 500 mM.
- Preparare 1.000 mL di tampone catodico contenente 15 mM di Bis-tris e 50 mM di tricina in dH2O. Regolare il pH a 7,0.
- Preparare 200 mL di tampone catodico blu aggiungendo 0,04 g di Coomassie blue G-250 a 200 mL di tampone catodico.
- Preparare 1.000 mL di tampone anodico contenente 50 mM di Bis-tris in dH2O. Regolare il pH a 7,0.
- Preparare 2,5 mL di tampone campione contenente 750 mM di acido aminocaproico e il 5% di blu Coomassie G-250 in dH2O.
2. Preparazione dei lisati mitocondriali
- Placcare le celle il giorno prima della raccolta. Per le cellule HEK293 o 143B, utilizzare il terreno di Eagle's modificato (DMEM) di Dulbecco con il 10% di siero fetale bovino, l'1% di L-glutammina, 100 mg/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina. Far crescere le cellule in un incubatore per colture cellulari a +37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2. Assicurarsi che ci siano almeno 500.000 celle per ogni campione il giorno del prelievo.
- Lavare delicatamente le celle una volta con PBS ghiacciato. Evitare di staccare le celle dalla piastra. Raschiare le celle e pellettizzarle a 800 x g per 10 min a +4 °C.
- Lavare due volte il pellet della cella con PBS ghiacciato e centrifugare come al punto 2.2. Misurare la concentrazione di proteine con il metodo Bradford utilizzando un kit commerciale. Pellettare le celle a 800 x g per 10 min a +4 °C.
nota: Dopo la raccolta delle celle, eseguire tutti i passaggi a +4 °C e non vortici.
- Preparare 20 ml di PBS con l'inibitore della proteasi aggiungendo 200 μL di inibitore della proteasi 100x a 20 ml di PBS. Mantenere il ghiaccio. Risospendere le cellule in PBS con l'inibitore della proteasi a una concentrazione proteica finale di 5 mg/mL.
- Per calcolare il volume di PBS con inibitore della proteasi necessario per risospendere le cellule a 5 mg/mL, calcolare la quantità di proteine in ciascun campione. Per questo calcolo, utilizzare la concentrazione proteica misurata nella fase 2.3 e il volume di PBS utilizzato per risospendere le cellule dopo il lavaggio nella fase 2.3.
- Preparare 1 mL di 3,3 mM di digitonina in PBS con inibitore della proteasi. Aggiungere 3,3 mM di digitonina a una concentrazione finale di 1,65 mM. Mescolare bene e incubare con ghiaccio per 5 minuti.
- Per preparare 1 mL di 3,3 mM di digitonina in PBS con inibitore della proteasi, sciogliere 4 mg di digitonina in 1 mL di PBS a 100 °C fino a quando non è visibile alcun precipitato e raffreddare immediatamente su ghiaccio. Aggiungere 10 μL di inibitore della proteasi 100x a 1 mL di soluzione di digitonina.
nota: Utilizzare solo una soluzione fresca di digitonin.
cautela: La digitonina è tossica! Usa una maschera facciale, guanti e un camice da laboratorio.
- Aggiungere PBS con inibitore della proteinasi (preparato al punto 2.4) al volume finale di 1,5 mL. Centrifugare a 10.000 x g per 10 minuti a +4 °C. Rimuovere il surnatante. In questa fase, i mitocondri vengono pellettati.
- Risospendere il pellet mitocondriale nel tampone mitocondriale. Il volume del tampone mitocondriale è la metà del volume del PBS nel passaggio 2.4.
- Preparare il laurilmaltoside fresco al 10% in PBS contenente inibitore della proteasi (preparato al punto 2.4). 1 ml è sufficiente per 10 campioni. Aggiungere il 10% di lauril maltoside alla concentrazione finale dell'1%. Incubare con ghiaccio per 15 minuti (questo passaggio può durare fino a un paio d'ore).
- Centrifugare a 20.000 x g per 20 minuti a +4 °C. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Misurare la concentrazione di proteine con il metodo Bradford utilizzando un kit. Aggiungere il tampone campione, un volume che è la metà del volume di lauril maltoside utilizzato nel passaggio 2.8. I campioni possono essere conservati a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
3. Preparazione del gel sfumato per BN-PAGE
- Versare il gel sfumato per BN-PAGE a temperatura ambiente. Posizionare il creatore di gradienti su una piastra di agitazione e collegarlo con un tubo flessibile alla pompa peristaltica. Collegare un set per infusione con l'ago al tubo. Posizionare un agitatore magnetico nella camera prossimale del creatore di gradienti. Lavare il tubo con dH2O alla massima velocità della pompa per 10 min.
- Svuotare il tubo e il creatore di gradienti. Utilizzare una pipetta per rimuovere eventuali residui di dH2O nel canale tra le camere del creatore di gradienti. Chiudere il canale e il tubo con la valvola.
- Utilizzando il telaio di colata e i morsetti, assemblare due lastre di vetro nel supporto, che ha un foro sul fondo, e posizionarlo sul supporto. Assicurati che sia più o meno su una superficie diritta con una bilancia idrica. Posizionare l'ago collegato al tubo tra le lastre di vetro.
- Preparare soluzioni in gel al 6% e al 15% (Tabella 2). Mantenere il ghiaccio. Aggiungere per ultimi il persolfato di ammonio (APS) e la tetrametilendiammina (TEMED) (iniziano la polimerizzazione). Mescolate delicatamente per evitare di fare bolle d'aria.
- Caricare l'estremità prossimale della camera del tubo del miscelatore di gel a gradiente con il 6% di gel e l'estremità distale con il 15% di gel. Il volume totale del gel deve essere uguale al volume del gel di separazione tra le lastre di vetro. Pertanto, utilizzare 2,6 ml di gel al 6% e 2,1 ml di gel al 15% nel miscelatore di gel sfumato per un gel di dimensioni 8,3 cm x 7,3 cm.
- Accendere l'agitatore magnetico e aprire il tubo e il canale tra le camere del creatore di gradienti. Accendere immediatamente la pompa peristaltica a 5 mL/min. Riempi le lastre di vetro e non permettere alle bolle di entrare nel gel. Rimuovere l'ago quando non c'è gel nel tubo.
- Sovrapporre delicatamente il gel con dH2O. Mantenere il gel a temperatura ambiente per almeno 1 ora per la polimerizzazione.
- Subito dopo aver versato il gel, lavare il tubo riempiendo le camere di gradiente con dH2O e utilizzando la pompa peristaltica alla massima velocità. Quando si preparano due o più gel, pulire sempre il sistema tra un gel e l'altro.
- Preparare 1x tampone gel mescolando 3 mL di 3x tampone gel e aggiungere 6 mL di dH2O. Rimuovere delicatamente dH2O dalla superficie del gel con carta da filtro. Lavare la superficie del gel con 1x gel tampone. Rimuovere delicatamente 1x tampone in gel con carta da filtro.
- Evita le fibre della carta da filtro sul gel. Per garantire ciò, tagliare la carta a pezzetti con le forbici, ma non strappare la carta.
- Posiziona il pettine tra le lastre di vetro, ma non immergerlo completamente per poter versare il gel impilabile sotto il pettine. Preparare il gel da impilare al 4% (Tabella 2). Aggiungi APS e TEMED per ultimi poiché iniziano facilmente la polimerizzazione. Mescolare delicatamente evitando bolle d'aria.
- Sovrapporre il gel da impilare, evitando bolle sotto il pettine, e immergere completamente il pettine. Lasciare polimerizzare il gel da impilare per almeno 30 minuti. Rimuovere il pettine e lavare i pozzetti con 1x tampone in gel utilizzando una pipetta.
- Dopo la polimerizzazione, il gel può essere conservato a +4 °C per un paio di giorni. Per conservare il gel, avvolgere il gel in carta imbevuta di dH2O e pellicola di plastica per evitare che il gel si secchi.
4. Elettroforesi su gel nativo blu
NOTA: Per prevenire la degradazione dei complessi OXPHOS, eseguire l'elettroforesi a +4 °C. Utilizzare tamponi pre-raffreddati.
- Caricare la cassetta del gel con il tampone catodico blu fino al fondo dei pozzetti. Il caricamento dei campioni è più facile quando la cassetta non è riempita fino in cima. Lavare i pozzetti con il tampone catodico blu e quindi riempire i pozzetti con il tampone catodico blu utilizzando una pipetta.
- Caricare i campioni (5-30 μg di proteine) nei pozzetti. Riempire delicatamente la cassetta del gel fino in cima con il tampone catodico blu e il serbatoio con il tampone anodico.
- Far funzionare il gel per 15 minuti a una tensione costante di 40 V. Quindi aumentare la tensione a 80 V (o utilizzare una corrente costante di 6 mA), non superare i 10 mA. Eseguire il gel fino a quando il colorante raggiunge i 2/3 della lunghezza del gel.
- Sostituire il tampone catodico blu con il tampone catodico e continuare l'elettroforesi fino all'esaurimento del fronte del colorante. In totale, l'elettroforesi dura circa 3 ore.
- Recuperare le lastre di vetro e trasferire le proteine sulla membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) mediante tamponamento semi-secco.